聚合酶鏈式反應的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性很好）的作用下，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸,，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成,，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。熱啟動聚合酶鏈式反應：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術,。南京微量RT-PCR檢測技術應用

聚合酶鏈式反應：模板的制備，PCR的模板可以是DNA,，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象,，可以是病原體標本如病毒,、細菌、菌類等,。也可以是病理生理標本如細胞,、血液、羊水細胞等,。法醫(yī)學標本有血斑,、精斑、毛發(fā)等,。標本處理的基本要求是除去雜質(zhì),，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細菌,，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚,、氯仿抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應模板。南京微量RT-PCR檢測技術應用聚合酶鏈反應可以用于分析病癥,、微生物或其他疾病狀態(tài)中基因表達水平的變化,。

聚合酶鏈式反應是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法,。PCR技術類似于DNA的天然復制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DN段,，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克,、微克、毫克級的特異性DN段,。因此,，PCR技術一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學的各個領域?！‘惓＝Y果： 各種疾病所致的異常,，例如梅毒。一期梅毒,。即硬下疳 ,，潛伏期2-4周，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ,，有軟骨樣硬度，周圍淋巴結腫大,。二期梅毒,。在一期梅毒 1-2 個月之后，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對稱泛發(fā)皮疹,、斑疹、,、疹等,。粘膜可發(fā)生粘膜斑、扁平濕疣,，傳染性強,。三期梅毒。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年,，皮膚為樹膠樣腫,，還可涉及骨、關節(jié)、心,、血管,，表現(xiàn)為主動脈炎、主動脈瓣閉鎖不全和主動脈瘤等,，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ,，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等?！⌒枰獧z查的人群：疑似某種特定的疾病病人,，進行分子特異性檢查。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過少：退火溫度不合適,。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度,。DNA模板量太少。增加DNA模板量,。PCR循環(huán)數(shù)不足,。增加反應循環(huán)數(shù)。引物量不足,。增加體系中引物含量,。延伸時間太短。以1 kb/min的原則設置延伸時間,。變性時間過長,。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑,。確保DNA模板干凈,。擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高。減少酶量,；酶的質(zhì)量差,，調(diào)換另一來源的酶。dNTP濃度過高,。減少dNTP的濃度。重疊延伸聚合酶鏈反應用于連接含有基因,、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段,。

聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下,，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物,。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應,。通過利用混沌流場的出現(xiàn),，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR,。這種對流聚合酶鏈反應設置明顯降低了設備功率需求和操作時間,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA,。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜,，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點,。如果基因的基因組DNA序列是已知的,，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置?；虻?’端(對應于轉(zhuǎn)錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中,。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克量級的起始待測模板擴增到微克水平,。南通細胞RT-PCR檢測技術原理

嵌套聚合酶鏈反應：通過減少DNA非特異性擴增的背景,，提高DNA擴增的特異性。南京微量RT-PCR檢測技術應用

聚合酶鏈式反應：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列,，因為它在合成過程中測量濃度,。有兩種方法可以同時檢測和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料,。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標記的探針,。只有在探針與其互補DNA雜交后，才能使用這些方法檢測DNA,。一種有趣的技術組合是實時PCR和逆轉(zhuǎn)錄,。這種復雜的技術被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA,。通過這種組合技術,，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進一步定量,。這種技術降低了聚合酶鏈反應終點出錯的可能性,，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關的基因的機會。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控,。南京微量RT-PCR檢測技術應用