聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖,，前者比后者多了一個(gè)O，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同,，即O原子造成U和T的不同,，U分子化學(xué)式C4H4N2O2，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2,，現(xiàn)在將兩個(gè)分子式進(jìn)行對(duì)比,，U比T多了CH2，結(jié)合前面的核糖區(qū)別,，還有一個(gè)O分子,，其余結(jié)構(gòu)相同，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2,？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結(jié)構(gòu)上說，直接從U中加入一個(gè)CH2,，得到了T,，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組，但是這樣一來的話,，即使U變成了T,，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個(gè)O分子，只是此時(shí)結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了,。此時(shí)將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中，表達(dá)的性質(zhì)一定不同于病毒表達(dá)的性質(zhì),。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO,、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu),。南京分子生物學(xué)熒光PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法,，故又稱為基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DN段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克,、微克,、毫克級(jí)的特異性DN段。因此,，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而較廣地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,?！‘惓＝Y(jié)果： 各種疾病所致的異常，例如梅毒,。一期梅毒,。即硬下疳 ，潛伏期2-4周,，外生殖器部位發(fā)生暗紅色硬腫塊 ,、淺潰瘍 ，有軟骨樣硬度,，周圍淋巴結(jié)腫大,。二期梅毒。在一期梅毒 1-2 個(gè)月之后,，全身皮膚,、粘膜發(fā)生對(duì)稱泛發(fā)皮疹、斑疹,、,、疹等。粘膜可發(fā)生粘膜斑,、扁平濕疣，傳染性強(qiáng),。三期梅毒,。發(fā)生在染上后2-3年乃至10年，皮膚為樹膠樣腫,，還可涉及骨,、關(guān)節(jié)、心,、血管,，表現(xiàn)為主動(dòng)脈炎、主動(dòng)脈瓣閉鎖不全和主動(dòng)脈瘤等,，侵及神經(jīng)為脊髓癆 ,，全身麻痹 ( 麻痹性癡呆 )等等?！⌒枰獧z查的人群：疑似某種特定的疾病病人,，進(jìn)行分子特異性檢查。溫州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝,。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下,，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子,，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是,，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個(gè)循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床。

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,，保持RNA的完整性,。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂,；為了防止非特異性擴(kuò)增,，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量,。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）,、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差,、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差,；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度,、序列,、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān),。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定,；防止DNA的污染： 采用DNA酶處理RNA,； 在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子,，以消除基因和mRNA的共線性,。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置,。

聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)主要限制是,，為了產(chǎn)生允許其選擇性擴(kuò)增的引物，需要關(guān)于目標(biāo)序列的先前信息,。這意味著,，通常情況下，PCR用戶必須知道兩個(gè)單鏈模板中每個(gè)模板上目標(biāo)區(qū)域上游的精確序列,，以確保DNA聚合酶正確結(jié)合引物-模板雜交體,，并隨后在DNA合成過程中產(chǎn)生整個(gè)目標(biāo)區(qū)域。像所有酶一樣,，DNA聚合酶也容易出錯(cuò),，這反過來會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。PCR的另一個(gè)限制是,，即使是很少量的污染DNA也可以被擴(kuò)增,，導(dǎo)致誤導(dǎo)或模糊的結(jié)果。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間,。試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中,。應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器。PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,，能將皮克量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克水平,。常州微量熒光定量PCR服務(wù)

電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。南京分子生物學(xué)熒光PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul?；?00ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時(shí),，一定要模索條件，否則容易失敗,。物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性,；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。南京分子生物學(xué)熒光PCR網(wǎng)站