聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Taq(水生棲熱菌)聚合酶耐熱DNA聚合酶的很好活性溫度約為75-80°C(167-176°F),盡管該酶通常使用72°C(162°F)的溫度,。在該步驟中,，DNA聚合酶通過從反應(yīng)混合物中添加在5’-至-3’方向上與模板互補(bǔ)的游離DNA鏈來合成與DNA模板鏈互補(bǔ)的新DNA鏈，在新生(伸長)DNA鏈的末端,，將dNTPs的5'-磷酸基與3'-羥基縮合,。延伸所需的精確時(shí)間取決于所使用的DNA聚合酶和要擴(kuò)增的DNA目標(biāo)區(qū)域的長度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，在很好溫度下,，大多數(shù)DNA聚合酶每分鐘聚合一千個(gè)堿基。在很好條件下(即,，如果沒有限制底物或試劑的限制),，在每個(gè)延伸/延伸步驟中，DNA靶序列的數(shù)量加倍,。隨著每一個(gè)連續(xù)的循環(huán),，原始模板鏈加上所有新產(chǎn)生的鏈成為下一輪延伸的模板鏈，導(dǎo)致特定DNA目標(biāo)區(qū)域的指數(shù)(幾何)擴(kuò)增,。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功,，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識,。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈反應(yīng)也可以用作以下敏感試驗(yàn)的一部分組織分型，對移植至關(guān)重要,。截至2008年,，甚至有人提議用聚合酶鏈反應(yīng)檢測取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測。許多形式的病癥涉及致病基因的改變,。通過使用基于聚合酶鏈反應(yīng)的測試來研究這些突變,，醫(yī)治方案有時(shí)可以根據(jù)患者的不同而不同。聚合酶鏈反應(yīng)可以早期診斷惡性疾病,，如白血病和淋巴瘤,，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的，并且已經(jīng)被常規(guī)使用,。PCR檢測可以直接在基因組DNA樣品上進(jìn)行,，以檢測易位特異性惡性細(xì)胞，其靈敏度至少是其他方法的10,，000倍,。聚合酶鏈反應(yīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有用，因?yàn)樗试S分離和擴(kuò)增病癥抑制劑,。例如,，定量PCR可以用于量化和分析單細(xì)胞，以及識別DNA,、mRNA和蛋白質(zhì)的確認(rèn)和組合,。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：RNA和DNA的五碳糖,，前者比后者多了一個(gè)O,，由于多出來的O原子造成了RNA和DNA的堿基不同，即O原子造成U和T的不同,，U分子化學(xué)式C4H4N2O2,，T胸腺嘧啶化學(xué)式C5H6N2O2，現(xiàn)在將兩個(gè)分子式進(jìn)行對比,，U比T多了CH2,，結(jié)合前面的核糖區(qū)別，還有一個(gè)O分子,，其余結(jié)構(gòu)相同,，那么O和CH2之間的聯(lián)系是什么?是什么導(dǎo)致DNA和RNA的區(qū)別是RNA比DNA多了O和CH2？或者說如何將病毒的堿基中U變成DNA堿基中的T,？若從結(jié)構(gòu)上說,，直接從U中加入一個(gè)CH2，得到了T,，這里面介入化學(xué)鍵的斷裂和重組,，但是這樣一來的話,，即使U變成了T，但是核糖依舊是RNA比DNA多了一個(gè)O分子,，只是此時(shí)結(jié)構(gòu)是某分子=核糖（C4H9O4CHO）+堿基（A T G C）,，形成了RNA的五碳糖+DNA的堿基這種分子了。此時(shí)將這種分子導(dǎo)入受體細(xì)胞（亦或者蛋白質(zhì)）中,，表達(dá)的性質(zhì)一定不同于病毒表達(dá)的性質(zhì),。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)頭等均應(yīng)一次性使用。必要時(shí),，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過少：退火溫度不合適,。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度,。DNA模板量太少。增加DNA模板量,。PCR循環(huán)數(shù)不足,。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。引物量不足,。增加體系中引物含量,。延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間,。變性時(shí)間過長,。變性時(shí)間過長會導(dǎo)致DNA聚合酶失活,。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈,。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過高,。減少酶量；酶的質(zhì)量差,，調(diào)換另一來源的酶,。dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度,。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決,。上海特殊樣本Real-time PCR研究方案

PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物,。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈,，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃,、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。蘇州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站