聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ),、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。為了很大限度地減少污染的可能性,，調(diào)查人員應(yīng)該為試劑制備,、聚合酶鏈反應(yīng)和產(chǎn)品分析預(yù)留單獨(dú)的房間。常州實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法,。將溶液置于熱梯度下,，而不是反復(fù)加熱和冷卻聚合酶鏈反應(yīng)混合物,。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)對(duì)流流動(dòng)自動(dòng)將聚合酶鏈反應(yīng)試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復(fù)啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng),。通過利用混沌流場(chǎng)的出現(xiàn),，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR,。這種對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時(shí)間,。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)):用于從RNA中擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ,，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增,。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列,，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn),。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置,?；虻?’端(對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))通常通過 RACE-PCR (快速擴(kuò)增cDNA末端)中。常州實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：10×擴(kuò)增緩沖液、4種dNTP混合物（終濃度）,、引物（終濃度）,、模板DNA、Taq DNA聚合酶,、Mg2+（終濃度）,、補(bǔ)加雙蒸水等。其中dNTP,、引物,、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或濃度）可根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整,，以上表格只提供大致參考值,。PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DN段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）,、酶,、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）,。引物有多種設(shè)計(jì)方法,，由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定，但基本原則相同,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,，PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此,，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā),、皮膚或血液，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,，就能用PCR加以放大,，進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在,。由1983年美國(guó)首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法,，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù),。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）,，5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp,，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳,，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照,。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)是一種用于DNA指紋識(shí)別的聚合酶鏈反應(yīng)方法。常州實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)

嵌套聚合酶鏈反應(yīng)：通過減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景,，提高DNA擴(kuò)增的特異性,。常州實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力]增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過研究減數(shù)分裂后染色體交叉來進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子,，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見的交叉事件,。類似地，可以分析異常的缺失,、插入,、易位或倒位,，所有這些都無需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過程,。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因,，突變由科學(xué)家隨意選擇?？梢赃x擇這些突變來理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的,，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。常州實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)