聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異),。它需要事先知道DNA序列,，包括等位基因之間的差異,，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對緩沖液),。在模板和引物不匹配的情況下，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多,，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性,。有關(guān)更多信息，請參見單核苷酸多態(tài)性基因分型,。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對具有短重疊片段的長寡核苷酸池進(jìn)行PCR來人工合成長DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替,，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序,，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物。PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合,。連云港特殊樣本RT-PCR檢測技術(shù)研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下,，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈,。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，加入設(shè)計引物,，DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是,，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展,。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶,，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,，并逐步應(yīng)用于臨床,。深圳實時RT-PCR檢測技術(shù)哪家好PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小,，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不完全互補,、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低,，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物,。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）,。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計：PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物。設(shè)計引物時以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）,，5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補,。引物設(shè)計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右,。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC很好隨機分布,，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列,。

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T）,，一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低,；溫度高,，不容易退火但特異性高。退火時間30秒,。延伸溫度一般在70～75度這時TaqDNA聚合酶活性很高（150個/S）,，當(dāng)引物在16個堿基以下時可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成,。一般<1KB時間1分鐘即可,。當(dāng)〈1KB時在較后的循環(huán)中延長擴(kuò)增時間。循環(huán)次數(shù)25～30次,。無產(chǎn)物時：取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增,；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù),；降低退火溫度,；加靶DNA量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。無錫微量熒光定量PCR方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO、甘油等,，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。連云港特殊樣本RT-PCR檢測技術(shù)研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù),，它能以極少量的DNA為模版,，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑,。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝,。在實驗中發(fā)現(xiàn),，DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此,，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶,、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制,。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活,，因此,，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣,，而且價格昂貴,，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷,、同時也降低了成本,，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床,。連云港特殊樣本RT-PCR檢測技術(shù)研究方案