二代測(cè)序——轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程（下）

測(cè)序

根據(jù)研究需求和預(yù)算選擇合適的測(cè)序平臺(tái),，如 Illumina 測(cè)序平臺(tái),。它的測(cè)序原理主要是邊合成邊測(cè)序（SBS）。在測(cè)序過程中,，dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）帶有不同顏色的熒光標(biāo)記,，當(dāng)新的 dNTP 加入到正在合成的 DNA 鏈時(shí)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)來確定堿基類型,，從而讀取 cDN**段的序列,。測(cè)序深度（覆蓋度）也是一個(gè)重要參數(shù)，一般來說,，測(cè)序深度越高,，檢測(cè)到的低表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的概率就越大，但成本也會(huì)相應(yīng)增加,。

數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制是第一步,，要去除低質(zhì)量的 reads（如含有較多不確定堿基 “N” 的 reads）和接頭序列。然后將高質(zhì)量的 reads 比對(duì)到參考基因組或轉(zhuǎn)錄組上,，常用的比對(duì)軟件有 TopHat,、STAR 等。在確定了 reads 的位置后,，就可以計(jì)算轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量,，常用的方法有 RPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）、FPKM（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）等,。此外,，還可以進(jìn)行差異表達(dá)分析,，找出在不同樣本條件下（如疾病組和健康組）表達(dá)量有***差異的轉(zhuǎn)錄本，用于后續(xù)的功能注釋和通路分析,，了解這些轉(zhuǎn)錄本可能參與的生物學(xué)過程和信號(hào)通路,。 二代測(cè)序需要分析嗎？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序

一代,、二代,、三代測(cè)序的區(qū)別分別是什么？

一代測(cè)序是上世紀(jì)70年代由Sanger和Coulson開創(chuàng)的DNA雙脫氧鏈終止法測(cè)序,，也稱為Sanger測(cè)序,。

二代測(cè)序技術(shù)(NGS)是為了改進(jìn)一代測(cè)序通量過低的問題而出現(xiàn)的，能夠同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了大規(guī)模,、高通量測(cè)序的目標(biāo),。

三代測(cè)序主要有兩種技術(shù)PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore 的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，這兩種技術(shù)的測(cè)序讀長都可以達(dá)到幾-kb的級(jí)別,，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于二代測(cè)序技術(shù),。 內(nèi)蒙古哪里有二代測(cè)序分析二代測(cè)序是2005年以后開始的嗎？

關(guān)于二代測(cè)序的簡(jiǎn)介：

二代測(cè)序技術(shù)(Next-Generation Seguencing,NGS)也稱為高通量測(cè)序技術(shù),，是一種能夠同時(shí)對(duì)數(shù)百萬甚至數(shù)十億個(gè) DNA片段進(jìn)行測(cè)序的方法,。與傳統(tǒng)的桑格測(cè)序相比二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性,、高靈敏度和低成本等優(yōu)勢(shì),。

二代測(cè)序技術(shù)在大幅提高了測(cè)序速度的同時(shí)，大幅度的降低了測(cè)序成本,，保持了高準(zhǔn)確性,，以前完成一個(gè)人類基因組的測(cè)序需要3年時(shí)間，而使用二代測(cè)序技術(shù)則需要1周,，但其序列讀長方面比起一代測(cè)序技術(shù)則要短很多,，大多只100bp-150bp。

二代測(cè)序——質(zhì)量控制類問題

如何評(píng)估二代測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量：主要通過一些質(zhì)量指標(biāo)來評(píng)估,，如Q值（質(zhì)量值）分布,，用于衡量每個(gè)堿基的測(cè)序質(zhì)量；堿基含量分布,，檢查四種堿基的比例是否正常,；GC含量分布，看是否與預(yù)期的基因組GC含量相符,；序列重復(fù)度,，評(píng)估數(shù)據(jù)中重復(fù)序列的比例；比對(duì)率,，即測(cè)序數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)上的比例等,。影響二代測(cè)序質(zhì)量的因素有哪些：樣本質(zhì)量是關(guān)鍵因素之一，如DNA的純度,、完整性和濃度等會(huì)影響文庫構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果,；文庫構(gòu)建過程中的操作不當(dāng)，如片段化過度,、接頭連接效率低等,；測(cè)序儀器的性能和運(yùn)行狀態(tài)，包括試劑的質(zhì)量,、測(cè)序芯片的質(zhì)量,、儀器的校準(zhǔn)等；生物信息學(xué)分析過程中的參數(shù)設(shè)置和算法選擇也會(huì)對(duì)**終的結(jié)果質(zhì)量產(chǎn)生影響,。 高通量測(cè)序是二代測(cè)序嗎,？

一代、二代,、三代測(cè)序的技術(shù)原理和技術(shù)特點(diǎn)分別是什么,？

技術(shù)原理：

一代—雙脫氧終止法

二代—橋式PCR+4色熒光可逆終止+激光掃描成像

三代—PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)

技術(shù)特點(diǎn)：

一代—只能檢測(cè)序列一致的PCR產(chǎn)物；讀長可以較長,，比如Sanger可以達(dá)到幾百bp,；通量低，一次只能檢測(cè)少量的序列,；成本低,；

二代—可以并行測(cè)序；需要放大信號(hào)才能檢測(cè),；通量大,，可以產(chǎn)生上G的reads；讀長較短,，一-般是固定的,，比如50、100,、150,、250等；成本較高

三代：可以并行測(cè)序,；不需要放大信號(hào),，對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行測(cè)序；通量大,，比如SequelII平臺(tái),，一張芯片可以有800萬個(gè)ZMW；讀長較長,；測(cè)序精確度較差,；成本高,； 二代測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是高靈敏度。新疆二代測(cè)序運(yùn)用

二代測(cè)序的原理是什么,？北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序

二代測(cè)序——技術(shù)原理類問題

二代測(cè)序與一代測(cè)序的區(qū)別是什么：一代測(cè)序技術(shù)如Sanger測(cè)序,，一次只能讀取一條DNA序列，通量低,、速度慢,、成本高，但準(zhǔn)確性高,，適用于對(duì)少量基因片段的精確測(cè)序,。而二代測(cè)序技術(shù)具有高通量、速度快,、成本低等優(yōu)點(diǎn),，可以同時(shí)對(duì)大量DNA分子進(jìn)行測(cè)序，但在單個(gè)堿基的準(zhǔn)確性上稍低于一代測(cè)序,，二者在不同的應(yīng)用場(chǎng)景中各有優(yōu)勢(shì),。二代測(cè)序有哪些主要的測(cè)序原理：主要包括邊合成邊測(cè)序和連接法測(cè)序。邊合成邊測(cè)序是在DNA聚合酶的作用下,，逐個(gè)添加帶有熒光標(biāo)記的dNTP,，通過檢測(cè)釋放的熒光信號(hào)來確定堿基序列；連接法測(cè)序則是利用DNA連接酶將寡核苷酸探針連接到模板DNA上,，根據(jù)連接的探針序列來推斷模板DNA的堿基組成,。 北京嘉安健達(dá)二代測(cè)序