二代測序的建庫步驟③

三,、末端修復(fù)和加A尾（以DNA文庫為例）

末端修復(fù)：經(jīng)過片段化后的DNA末端可能是不平齊的,，有5'-突出端或3'-突出端。末端修復(fù)反應(yīng)可以利用T4DNA聚合酶,、Klenow片段等酶,，將這些末端補平，使其成為平末端,。T4DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,，在合適的反應(yīng)緩沖液和dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）存在下，可以將突出的末端補平,。

加A尾：在末端修復(fù)后的平末端DNA分子的3'-末端加上一個A堿基,。這一步是為了后續(xù)連接帶有T-突出端的接頭做準(zhǔn)備，一般使用Klenow片段（3'→5'外切酶活性缺失）在dATP存在下進行加A反應(yīng),，這樣可以使DNA片段能夠高效地與帶有T-突出端的測序接頭連接,。 二代測序是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測序技術(shù)。貴州嘉安健達二代測序運用

什么樣本可以做二代測序,？③

細(xì)胞樣本

培養(yǎng)細(xì)胞：包括各種原代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系,。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，對培養(yǎng)的細(xì)胞進行測序可以了解細(xì)胞的基因特征和功能變化,。例如,，在研究細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時，對經(jīng)過特定刺激處理的培養(yǎng)細(xì)胞進行轉(zhuǎn)錄組測序,，以分析基因表達的上調(diào)或下調(diào)情況,。

脫落細(xì)胞：如痰液中的脫落細(xì)胞、尿液中的脫落細(xì)胞等,。這些細(xì)胞可以用于某些疾病的篩查,。例如，在肺*篩查中,，對痰液中的脫落細(xì)胞進行基因檢測,，通過二代測序?qū)ふ曳?相關(guān)的基因突變，作為一種非侵入性的檢測方法,。 寧夏哪里有二代測序運用二代測序是一種能夠同時對數(shù)百萬甚至數(shù)十個億DNA片段進行測序的方法,。

二代測序——應(yīng)用領(lǐng)域類問題

二代測序在**研究中的應(yīng)用有哪些：可用于**的早期篩查，通過檢測血液中的循環(huán)**DNA,；進行**的診斷分型,，確定**的基因突變特征；評估***效果,，監(jiān)測***過程中腫瘤細(xì)胞的基因變化,；預(yù)測**的預(yù)后，分析與預(yù)后相關(guān)的基因標(biāo)志物,；還可用于尋找**的新靶點,，為靶向***藥物的研發(fā)提供依據(jù),。二代測序在遺傳病診斷中的優(yōu)勢和局限性：優(yōu)勢在于能夠快速、***地檢測基因組中的變異,，包括單核苷酸變異,、小插入缺失、拷貝數(shù)變異等,，提高了遺傳病的診斷率,。局限性在于對于復(fù)雜基因組區(qū)域的檢測可能存在困難，如高度重復(fù)序列區(qū)域,；檢測到的變異需要進一步的功能驗證和臨床解讀,，部分變異的致病性難以確定；此外,，成本相對較高,，對于一些罕見病的診斷，可能需要較大的樣本量和更深入的分析,。

二代測序技術(shù)在不同人群中的準(zhǔn)確性有何差異③

孕婦及胎兒

優(yōu)勢：無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（NIPT）是二代測序技術(shù)用于孕期胎兒常見染色體非整倍體篩查的應(yīng)用,，對于唐氏綜合征、18-三體綜合征,、13-三體綜合征等染色體異常疾病的檢測準(zhǔn)確率分別能達到95%,、85%、75%以上,，明顯高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查,。

局限性：孕婦外周血中胎兒游離DNA來源于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞，可能與胎兒實際情況不一致,，導(dǎo)致假陽性,。母親若合并免疫疾病、凝血功能障礙等,，會使外周血中游離DNA含量過高,，掩蓋胎兒來源的游離DNA，造成假陰性510. 一代,、二代,、三代測序的區(qū)別是什么？

二代測序——技術(shù)原理類問題

二代測序與一代測序的區(qū)別是什么：一代測序技術(shù)如Sanger測序,，一次只能讀取一條DNA序列,，通量低、速度慢,、成本高，但準(zhǔn)確性高,，適用于對少量基因片段的精確測序,。而二代測序技術(shù)具有高通量,、速度快、成本低等優(yōu)點,，可以同時對大量DNA分子進行測序,，但在單個堿基的準(zhǔn)確性上稍低于一代測序，二者在不同的應(yīng)用場景中各有優(yōu)勢,。二代測序有哪些主要的測序原理：主要包括邊合成邊測序和連接法測序,。邊合成邊測序是在DNA聚合酶的作用下，逐個添加帶有熒光標(biāo)記的dNTP,，通過檢測釋放的熒光信號來確定堿基序列,；連接法測序則是利用DNA連接酶將寡核苷酸探針連接到模板DNA上，根據(jù)連接的探針序列來推斷模板DNA的堿基組成,。 二代測序使用的是哪種設(shè)備,？長寧區(qū)二代測序運用

RNA測序也是二代測序。貴州嘉安健達二代測序運用

不同二代測序技術(shù)平臺的速度

Illumina 測序平臺：這是目前市場上應(yīng)用較為***的二代測序平臺之一,，其測序速度較快,。例如 Illumina NovaSeq 系列，一次運行可以在 1-3 天內(nèi)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù),，通量可達數(shù)億甚至數(shù)十億條讀長,，能夠滿足大規(guī)模基因組學(xué)研究和臨床檢測的需求,。

Roche 454 測序平臺：Roche 454 測序系統(tǒng)的測序速度也較快,，其特點是測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長能達到 400bp 左右,，一次運行可以在 24 小時左右完成對一定數(shù)量樣本的測序,。

BGISEQ 系列：華大智造的 BGISEQ 系列測序儀在速度上也有出色表現(xiàn)，如全球二代測序速度**快設(shè)備 E25 量產(chǎn),，為快速測序提供了有力支持 貴州嘉安健達二代測序運用