常規(guī)生物學實驗中,，實時定量PCR技術(shù)（RT-PCR）普遍用于microRNA的檢測實踐中,，但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,，普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足,。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),，成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù),。微滴式數(shù)字PCR（DropletdigitalPCR）,，又成為“油包水PCR”，在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理,，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴,，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子,。經(jīng)PCR擴增后,，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1,，沒有熒光信號的微滴判讀為0,，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體具有異質(zhì)性,，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別,。細胞外泌體NTA

細胞外囊泡是蛋白質(zhì)、mRNA,、miRNA和脂質(zhì)運輸來完成細胞間通訊通路的重要媒介,，根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為三類，包括外泌體,、微泡和凋亡小體,。其中，外泌體是直徑大約為40-100nm的包裝囊泡,，由多種細胞分泌,，內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì),、細胞因子或遺傳物質(zhì),。來源于不同的組織的外泌體不只具有其特異性蛋白分子，而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子,。近年來,，隨著外泌體研究的不斷深入，它的應用已經(jīng)涉及瘤子診療領(lǐng)域,、醫(yī)學基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域,、寄生蟲領(lǐng)域；臨床研究上已涉及心血管系統(tǒng),、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等,。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù),。exosome外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運融合蛋白annexins、RAN,、GTPases,。

AFC自動收集器是將qEV分離法這一過程自動化的儀器，將用來收集外泌體樣本的微量離心管放置在AFC的中間轉(zhuǎn)盤內(nèi),，根據(jù)稱重精確測量流體體積,，可精確的測量到樣品中每一個液滴的重量并精確測量總重量。將在空隙體積之前從qEV柱洗脫的流體收集到AFC轉(zhuǎn)盤的單獨中心孔中并送至廢液桶,，避免將不需要的空隙部分收集到微量離心管中,。在提取期間，當達到設(shè)定的提取體積后,，轉(zhuǎn)盤會自動旋轉(zhuǎn)到下一個微量離心管繼續(xù)收集,，到收集完成后自動停止。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)不佳有效提高了核酸分子的擴增效率,，而且由于采用微滴計數(shù)的方法進行定量,，可以不依賴與RT-PCR的熒光信號和Ct值，對所測樣品中的核酸分子進行一定定量,。

外泌體的提取主要包括以下幾種方式：1,、免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整,，特異性高,、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備,，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性,，不便進行下一步的實驗。2,、PS親和法,，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS,。該方法與免疫磁珠法相似,，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度較高,。由于不使用變性劑,，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射,。3,、色譜法，這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,，但是需要特殊的設(shè)備,，應用不普遍。外泌體作為核酸的藥物遞送載體,。NTA技術(shù)已被作為外泌體表征手段之一,。

外泌體的基本信息：1、外泌體的大?。和饷隗w的直徑約40-150nm,。2、從研究上來講并不太嚴格區(qū)分外泌體或微泡,。3,、外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡,。4,、外泌體的直接比微泡的要小，后者直徑為100nm-1μm,。5,、外泌體的數(shù)量：人體中大約有1014個，近乎于平均每個細胞產(chǎn)生1000-10000個,。6,、外泌體的細胞源：人體中幾乎所有類型的細胞均能產(chǎn)生外泌體。7,、外泌體具有異質(zhì)性,，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別。8,、外泌體的存在：外泌體幾乎存在于所有的組織,、細胞間隙、體液中,。9,、外泌體產(chǎn)生于細胞中的多泡體。外泌體可以將PD-L1轉(zhuǎn)運至其他PD-L1表達低或沒有PD-L1的細胞,，并可能與PD-1結(jié)合,。干細胞外泌體提取試劑盒

外泌體膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作為配體與細胞膜上的受體結(jié)合,，從而活躍細胞內(nèi)的信號通路,。細胞外泌體NTA

外泌體中常見的細胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種,。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細胞的融合,，有文獻報道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體?，F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白,。除了RAB蛋白,，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2,、4,、5、6,、7,、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）,、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細胞來源）,、MHC-Ⅱ(抗原提呈細胞來源)、CD86(抗原提呈細胞來源)以及乳凝集素（不成熟的樹突狀細胞）,。細胞外泌體NTA

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