細胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎,。細胞密度適中,，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片,。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗,，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,?？贵w稀釋度1：60，較常用,！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘,。抗體稀釋度1：400,，較常用,！10. 90%甘油封片。也很關鍵阿,，多封幾次才有體會,。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察,。免疫熒光技術具有高靈敏度和高特異性,，可以檢測非常低濃度的目標分子。OPG免疫組化

熒光素標記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準備：根據(jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結合（或稱標記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h,。結合期間應保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時添冰去水,；亦可將結合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。OPG免疫組化免疫熒光技術中，以熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術,。

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強,、敏感性高、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜,。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同,，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗中應用。

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時,，動作應輕柔,，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程,。（2）種細胞過程中,，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細胞局部生長過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后,，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi),，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照,。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。免疫熒光技術可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細胞定位。

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應,，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3應用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。使用已知熒光抗原標記物質(zhì)來檢查相應抗體的方法被稱為熒光抗原技術,。ERK免疫熒光試驗

免疫熒光技術可以用于研究免疫相關疾病和自身免疫病。OPG免疫組化

細胞免疫熒光步驟對大家來說一定是很陌生的,，他是一種抗原抗體反應,，好像對我們來說他顯得很遙遠的樣子，因為我們并不了解他能做什么,，通過這種技術可以讓我們對抗原或抗體的性質(zhì),、定位一次來分析出更多的數(shù)據(jù)。細胞免疫熒光,，這對很多人來說都是一次聽說這個東西,，也不知道他對我們會有什么好處與壞處,，科學研究就是這樣子的，普通老百姓是不會明白其中的道理的,，但是這些研究也是確實的在我們的生活中取得了成果,，能夠讓大家過的更加舒適。OPG免疫組化

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