免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細胞,、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理,，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，操作小心,，防止細胞脫片。對于懸浮細胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進行固定步驟,，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟,，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟,。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后,，可以直接進行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少,，要先進行脫蠟和抗原修復(fù)處理,。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。ALBUMIN免疫組化IHC

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原,，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng),，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥,、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體,，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性,，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此,，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷,。bcl-2免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用。

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上,，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法,。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過一定時間反應(yīng),，即可結(jié)合并顯色,。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng),，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物,。

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度,，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強度也較大。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7,、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時,。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時,。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。cyclinD1免疫抗體

在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進行免疫熒光實驗,。ALBUMIN免疫組化IHC

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光,。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間,，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低,，孵育是否時間過短等。ALBUMIN免疫組化IHC

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