細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗,，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60,，較常用！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘,；9加入熒光二抗，室溫30分鐘,?？贵w稀釋度1：400，較常用,！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會,。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測多個目標(biāo)分子,，通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記,。MYeloperoxidase免疫檢測

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時(shí)候要小心,，注意 反正面，放在皿里洗比較方便,，避免了來回夾取,，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來,。洗的時(shí)候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜,，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好,，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí),，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片,，指甲油封片子的四周,，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒桑圆挥弥讣子头獾脑挄囊凰?。MYeloperoxidase免疫檢測熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測。

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑,，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次,，每次3min，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清,，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清,。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥,，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉,。

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理,，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，操作小心,，防止細(xì)胞脫片。對于懸浮細(xì)胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟,，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟,，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟,。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后,，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少,，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。MYeloperoxidase免疫檢測

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。MYeloperoxidase免疫檢測

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透,。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果,；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間,，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低，孵育是否時(shí)間過短等,。MYeloperoxidase免疫檢測