免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時(shí)振蕩。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,，可以用于檢測(cè)病原體,、肉瘤標(biāo)志物等。ERK免疫檢測(cè)

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中的一個(gè)因素,，就可以查出另一個(gè)因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上,，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片,、鏡檢,。CK14免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）,；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透,。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果,；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低,，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度,。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高,；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定,，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。PD-1免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。ERK免疫檢測(cè)

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。ERK免疫檢測(cè)