CCK-8的原理

所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。為什么是粗略的呢,，因?yàn)檫@里沒有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低，有些細(xì)胞在***處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變,，但是代謝率低了以后,，細(xì)胞呼吸減弱,，NAD+產(chǎn)生減少,，測(cè)出的Formazan也會(huì)減少，所以此時(shí)怎么算呢（此時(shí)我就比較懷戀中性紅了）,？當(dāng)然也有解決的辦法,，下期給大家介紹。因此可利用這個(gè)原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析,，在吸光度為450時(shí)檢測(cè)讀數(shù),。用途及常用的公 無需放射性同位素和有機(jī)溶劑，對(duì)細(xì)胞毒性低.北京cck8 懸浮細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)原理：CellCountingKit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析,。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析,。北京cck8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后,，可以在不同時(shí)間反復(fù)用酶標(biāo)儀讀數(shù)從而找到比較好測(cè)定時(shí)間,。

、***濃度的確定需要做一個(gè)時(shí)間梯度,，鋪板和上述相同,，只需把各個(gè)實(shí)驗(yàn)組改成各個(gè)作用時(shí)間就可以了。至于說***濃度的確定,，網(wǎng)上有很多確認(rèn)方法,，個(gè)人建議以IC50值作為***濃度即可。計(jì)算方法,，某園子里都有,，就不在這里介紹了。

MTT作用之后,，一定要小心吸走培養(yǎng)液,，以免將孔內(nèi)的紫色結(jié)晶吸走,。有條件的實(shí)驗(yàn)室，這一步可以采用離心機(jī)將沉淀充分離心到孔底,，防止被吸出,。如果沒有這種類型的離心機(jī)，可以在測(cè)量吸光度的時(shí)候,，將酶聯(lián)免疫的機(jī)器震蕩時(shí)間調(diào)制5分鐘,，**起碼可以保證沉淀充分溶解。

四,、方法及步驟：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù),。2,、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液,，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù),。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí),，如果不需要貼壁,，這步可以省去。4,、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比較少,，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將***頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入,。CCK8細(xì)胞增值檢測(cè)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介.

,。一般情況下，**外一圈的孔只加培養(yǎng)基,，不作為測(cè)定孔用,。在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間,，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照,。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮***的吸收,，可在加入***的培養(yǎng)基中加入CCK8,，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照,。金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛,、氯化鐵、硫酸銅會(huì)***5%、15%,、90%的顯色反應(yīng),，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話,，將會(huì)*****,。懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間,。靈敏度高,，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好.北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)od值

在CCK-8試劑盒中,，**主要的化學(xué)藥品是WST-8.北京cck8 懸浮細(xì)胞

細(xì)菌***對(duì)CCK8檢測(cè)的影響：我們做***的,，經(jīng)常會(huì)做到細(xì)菌或***對(duì)細(xì)胞的影響。那這種情況下我們應(yīng)該怎么辦,。其實(shí)細(xì)菌防御系統(tǒng)還是非常強(qiáng)大,，單獨(dú)和CCK-8在一起孵育時(shí)，不會(huì)發(fā)生還原反應(yīng),，幾乎不會(huì)和細(xì)菌發(fā)生顯色反應(yīng),。而細(xì)菌不需要入胞繁殖，所以結(jié)果還是可信的,。**討厭的就是***,，我不知道有多少人是做***的。***是需要入胞繁殖的,，而且需要借助細(xì)胞的東西來進(jìn)行繁殖,。繁殖過程中就需要消耗宿主的能量，會(huì)產(chǎn)生氧化還原反應(yīng),，所以我用CCK-8來測(cè)定***對(duì)細(xì)胞活性的影響或者某個(gè)***對(duì)***復(fù)制的影響時(shí),，我都小心翼翼的測(cè)很多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，說實(shí)話,，效果不是很好,。所以我比較喜歡中性紅。北京cck8 懸浮細(xì)胞