貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全,，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便,。沒人愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3,、加藥后的孵育時(shí)間,，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h,，48h,，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）,、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時(shí)間。太長(zhǎng)了就沒有必要了,，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了,。4,、CCK8試劑加入量，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%,。這里有一個(gè)問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系,，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升,，cck8不算在體系內(nèi)呢,。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人**終采用的是后者,。CCK8的實(shí)驗(yàn)步驟,、實(shí)驗(yàn)分組及檢測(cè)方法.浙江cck8材料

CKK-8原理

CellCountingKit，CCK-8試劑含有WST-8（化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）,，是近年新開發(fā)的一種更新的水溶性四唑鹽檢測(cè),，原理與WST-1類似：在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,，用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定其光吸收值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,，在一定細(xì)胞數(shù)量范圍內(nèi)甲臜形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

浙江cck8英文培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā),，為減少誤差,，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。

統(tǒng)一鋪好后,，待細(xì)胞完全沉淀下來后,，在顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞密度，如果密度不均勻,，則固定一組,，微調(diào)其他組細(xì)胞的量再次鋪板（如：發(fā)現(xiàn)NC組細(xì)胞較多，降低細(xì)胞量再次鋪板）,，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。4.從鋪板后第二天開始，每孔加入10-20μlCCK-8溶液,，如果每孔的培養(yǎng)基為100μl,，則加入10μlCCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為200μl,，則加入20μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡,，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照,。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)就是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定,，常用的方法有MTT、CCK8以及流式檢測(cè)。閱讀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),，如果想證明一個(gè)***或者說是一個(gè)作用條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,，基本上大家都采用MTT或CCK8結(jié)合流式的雙標(biāo)準(zhǔn)來證明作用效果。所以,，***先給大家介紹一下MTT和CCK8比色法的實(shí)驗(yàn)操作和注意事項(xiàng),。MTT實(shí)驗(yàn)操作1、在96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞,，設(shè)置對(duì)照組（細(xì)胞+無血清培養(yǎng)基）,、實(shí)驗(yàn)組和空白組（無血清培養(yǎng)基），可以采用如下圖的排版方式：2,、在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中,，每孔加入細(xì)胞懸液100ulCCK8雖好,這些情況下不建議用!

CCK8的優(yōu)點(diǎn)：方法方便，不用洗滌細(xì)胞,，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑,；CCK-8快速檢測(cè)；CCK-8檢測(cè)靈敏度高,，細(xì)胞密度低也可以檢測(cè),；CCK-8的重復(fù)性優(yōu)于MTT法；CCK-8對(duì)細(xì)胞的毒性很??；CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中是1瓶溶液，不需要現(xiàn)用現(xiàn)配,，即開即用,。CCK8的缺點(diǎn)：相比于與MTT法，CCK8的價(jià)格比較昂貴生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析,。用途：***篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定,、細(xì)胞毒性測(cè)定,、**藥敏試驗(yàn)。使用方便,，省去了洗滌細(xì)胞,，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑.浙江cck8實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

CCK8系列簡(jiǎn)稱終于來了.浙江cck8材料

CCK8，即Cell Counting Kit-8,，與MTT法的主要區(qū)別如下：一,、原理不同1、Cell Counting Kit-8：CCK-8 試劑盒利用了日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開發(fā)的四唑鹽WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽),。2,、MTT法：其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜,，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。浙江cck8材料