五,、實驗注意事項：·若暫時不測定OD值,，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化,。·如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話,，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基）,，去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基,，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。·當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時,，貼壁細胞的**小接種量至少為1,000個/孔(100μl培養(yǎng)基),。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔(100μl培養(yǎng)基),。CCK8試驗的總體實驗心得.上海cck8作圖
細胞活性檢測1.在96孔板中接種細胞懸液(100ml/孔),。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5%CO2的條件下),。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,，它們會影響O.D值的讀數(shù)),。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。4.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度,。5.如果暫時不測定O.D值,，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。細胞增殖-毒性檢測1.在96孔板中配制100ml的細胞懸液,。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(在37℃，5%CO2的條件下),。上海cck8檢測計算CCK8細胞增殖實驗檢測原理.
CCK8,，即Cell Counting Kit-8，與MTT法的主要區(qū)別如下：一,、原理不同1,、Cell Counting Kit-8：CCK-8 試劑盒利用了日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開發(fā)的四唑鹽WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)。2,、MTT法：其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中,，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜,，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其光吸收值,，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比,。
用途：
***篩選、
細胞增殖測定,、
細胞毒性測定,、
**藥敏試驗等。
所需設(shè)備及儀器：
10ul,，100-200ul及多通道移液器
酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）
96孔培養(yǎng)板
二氧化碳培養(yǎng)箱
培養(yǎng)0.5-4小時:細胞種類不同,，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,，可以繼續(xù)培養(yǎng),，以確認比較好條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,，需要較長的顯色時間（5-6小時）,。
測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm,，參比波長600-650nm,。 CCK-8用途：***篩選,、細胞增殖測定、細胞毒性測定,、**藥敏試驗.
在做一些***毒性試驗時,，比如做鐵死亡途徑時，我們加入一個***叫C1,，這個時候就需要提前換液,，其實我們試過，還是會有一些影響,。所以這時我們用中性紅檢測,。我們實驗室，通常會用20%的硫酸銅溶液放到細胞孵箱下層,，預(yù)防******,。理應(yīng)說，硫酸銅分子在水溶液中是硫酸根離子和銅離子,，是不會揮發(fā)的,。但是每次只要是新?lián)Q的硫酸銅溶液再做CCK-8，結(jié)果總是不好,，我也不知道是什么原因,。之前在我們實驗室有發(fā)生過這樣的事情，這種有深有淺的才是該有的結(jié)果,。我想說的是在有能力選擇范圍內(nèi),，盡量選擇好一點的試劑，免得浪費時間,。不同的種板數(shù)對檢測***的IC50影響大嗎,？浙江celltiter glo 與cck8
無需放射性同位素和有機溶劑，對細胞毒性低.上海cck8作圖
在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時,，對于大多數(shù)情況孵育2小時左右就可以了,。6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度（使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱）測定完成后，保存數(shù)據(jù),。7.連續(xù)五天檢測,，每天保持一樣的時間點加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時間相同,。注：若暫時不測定OD值,，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24小時內(nèi)測定,，吸光度不會發(fā)生變化。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響,。當(dāng)然***影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可,。上海cck8作圖