膠原蛋白的提取方法：1.堿法提?。簤A法提取膠原蛋白常用的處理劑為石灰,、氫氧化鈉,、碳酸鈉等。如Holzer等[5]采用1%～1.5%石灰水浸泡的方法提取膠原蛋白,。由于它容易造成肽鍵水解,，因此得到的水解產物分子量比較低。所以,，若想保留膠原的三股螺旋結構,，此法不可取。2.鹽法提?。蝴}法提取膠原蛋白所用的中性鹽有鹽酸-三羥甲基胺基甲烷(Tris-HCl),、氯化鈉、檸檬酸鹽等,。在中性條件下,，當鹽的濃度達到一定量時，膠原溶解,。并且可采用不同濃度的氯化鈉對提取的膠原蛋白進行鹽析處理,，可以沉淀出不同類型的膠原蛋白。加到相應的培養(yǎng)器皿中,，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面,。杭州開封鼠尾膠原

鼠尾膠原凝膠體在皮膚細胞原代培養(yǎng)中的應用：在國外的藥理,毒理和皮膚病學的研究領域中已得到的限翩,否則培養(yǎng)成功率極低.本文采用鼠尾膠原凝膠體作為滋養(yǎng)層,提高了培養(yǎng)細胞的材料和方法r1]實驗材料:培養(yǎng)液DEIdE(G皿}ao),表皮細胞生長因子(EGFSigma),小牛血清(上海祟明生物制品廠),氫化可的松,胰島素(Sigm,青,鏈霉素,胰蛋白酶,]~DTA,細胞培養(yǎng)皿~35mill(00rningrSA).(2)皮膚基底細胞的分離和細胞懸液的制備:2～3d的新生大鼠(wisr),以75%酒精消毒背部皮膚,剪下皮膚后.以消化12h.輕刷表皮面,收集細胞懸液,加入細胞培養(yǎng)液.用梯度離心收集細胞,以3xi0/m]濃度接種平皿.(3)鼠尾膠原凝膠體的制備:具體方法參見文獻c13o(4)培養(yǎng)皿的膠原鋪制:i.0ml的酸溶解膠原滴入~35mm培養(yǎng)皿中,鋪滿平皿底部;將平皿暴露于氨氣中30min,然后置空氣中30rain,散盡剩余氨氣。寧波重慶鼠尾膠原制備鼠尾膠原：離心,，4000轉/分,，10-15分鐘。

鼠尾膠原醋酸溶解：1．將鼠尾膠原加入到0.1M的醋酸中,，制備成濃度為0.1%的溶液,。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中,，并小心的在瓶底鋪上一層氯仿,。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌,。在2-8度中放置過夜,。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化,。已經發(fā)現該方法會導致丟失蛋白,。3．稀釋一定數量的膠原溶液。4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶,。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜,。5．從包被表面除去多余的液體。過夜干燥,。如果膠原溶液不是無菌的,，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒,。在接種細胞前用無菌的水漂洗。

鼠尾膠原蛋白I型,，用那一種膠原酶可以溶解：1．將膠原加入到0.1M的醋酸中,，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解,。2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中,，并小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%,。不要晃動或攪拌,。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液,。我們不建議用過濾的方法無菌化,。已經發(fā)現該方法會導致丟失蛋白。3．稀釋一定數量的膠原溶液,。4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶,。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜。5．從包被表面除去多余的液體,。過夜干燥。如果膠原溶液不是無菌的,，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒,。在接種細胞前用無菌的水漂洗。本品可用于細胞培養(yǎng)皿的包被,，特別適合普通細胞培養(yǎng)器皿不易貼壁細胞的培養(yǎng),。

鼠尾膠原為貼附底物的人鼻腔纖毛上皮細胞的體外培養(yǎng)模式,為人鼻腔黏液纖毛運輸系統的研究提供科學有效的方法。方法制備鼠尾膠原并鋪片,以鼠尾膠原為貼附底物組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人鼻腔纖毛上皮細胞,培養(yǎng)7天時進行HE染色及掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞形態(tài)和結構,應用高速攝像技術測量纖毛擺動頻率,。結果鼠尾膠原要平坦均勻,平均厚度約為1mm;HE染色可見上皮細胞呈單層向周圍爬開;掃描電鏡下見纖毛上皮細胞呈不規(guī)則多角形,纖毛周圍可見微絨毛;透射電鏡下可見纖毛上皮細胞間為緊密連接;同一細胞任意兩點纖毛擺動頻率是相同的;同一來源體外培養(yǎng)的鉤突和下鼻甲的纖毛擺動頻率是相同的,。結論以鼠尾膠原為貼附底物人鼻腔纖毛上皮細胞的體外培養(yǎng)模式的成功建立,為今后研究鼻內用藥對纖毛除去功能的影響提供了良好的方法和途徑。方法制作鼠尾膠原,，觀察全細胞膜片鉗實驗中,，自制的鼠尾膠原對前庭毛細胞的貼壁黏附作用。蕪湖鼠尾膠原生產廠家

稱取胃蛋白酶加入到膠原溶脹液中,。杭州開封鼠尾膠原

鼠尾膠原膠凝程序：膠原蛋白I按以下步驟使其pH達到堿性時凝膠,。1）將無菌5cm左右的紗布海綿貼在150mm培養(yǎng)皿的蓋子上來制備氨蒸氣室。用氫氧化銨使紗布飽和,，把蓋子放在150mm的培養(yǎng)皿上,，暫放置一邊。2）將膠原蛋白I均勻涂布在要包被物的表面上,，厚度可以根據需要改變,，膠原蛋白I（50-100μL）足以涂覆22mm的蓋玻片,。對于直徑100mm的培養(yǎng)皿，每個加入約6mL;對于60mm培養(yǎng)皿添加約2.3mL,，對于35mm培養(yǎng)皿添加約1mL,。3）將涂有膠原蛋白的蓋玻片或帶有蓋子的培養(yǎng)皿轉移到氨蒸氣室并暴露三分鐘。4）在無菌蒸餾水中（35mm培養(yǎng)皿加5mL,，60mm培養(yǎng)皿加10mL等）浸泡涂布的蓋玻片或培養(yǎng)皿30min,。吸取原蒸餾水并加0.5-1.0mL無菌蒸餾水，放置在層流罩中過夜,。5）吸出蒸餾水,，用含血清的平衡鹽緩沖液溶液代替并保存在2-8°C。杭州開封鼠尾膠原