原代細胞的培養(yǎng)和維持：1.消化培養(yǎng)法2.懸浮細胞培養(yǎng)法對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞,、淋巴細胞,、骨髓細胞,、胸水和腹水中的細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離,，直接培養(yǎng),，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。3.部位培養(yǎng)部位培養(yǎng)是指從供體取得部位或組織塊后,，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng),，部位培養(yǎng)可保持部位組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯(lián)系,、排列情況和相互影響,，以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。將一管細胞從液氮罐中取出,，注意保護手和眼睛,。重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒哪里買

注意事項：所有相關器皿耗材都應為RNase-free產(chǎn)品，操作過程要小心,，帶口罩,、手套避免環(huán)境中RNA酶污染樣品,。RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之間，但這并不表示RNA不純,，需電泳檢測,。使用時一定要根據(jù)自己的實驗需要購買提取試劑盒，如果不是試劑盒,，或許能提出RNA,，但不能確保其質(zhì)量以及完整性，會影響RT-PCR,、Northernblot,、Dotblot、RealtimeRTPCR,、芯片分析,、polyA篩選、體外翻譯,、RNase保護分析,、分子克隆等后續(xù)實驗的結(jié)果。當前提取效果好的是RNA提取試劑盒,，但其售價較高,，單次實驗費用花費太大，對精度要求不高的實驗沒有必要購買,，當然還有其它的進口試劑盒,，但是均存在價格高、訂貨周期長的問題（如果碰上國內(nèi)無貨的時候,，要從國外發(fā)貨,，會等很長一段時間）。普通的提取實驗用國產(chǎn)的試劑盒就足以,，價格不高,，基本上各地均有現(xiàn)貨，如天根（國內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒中銷售面比較廣的一種）等,，其價格比進口試劑盒要便宜許多,，且效果還不錯，性價比還可以金華原代細胞分離試劑盒直銷價如果接種的細胞密度過低,，細胞之間的促生長作用很小,。

原代細胞的培養(yǎng)條件：靜置貼壁細胞(包括半貼壁細胞的培養(yǎng))培養(yǎng)：a.細胞要通過充分漂洗，以盡量除去消化液的毒性,。b.細胞接種時濃度要稍大一些,，至少為5×108細胞/L。c.培養(yǎng)基可用Eagle(MEMCorning10-010-CVR)或DMEM(Corning10-013-CVR)培養(yǎng),。d.胎牛血清濃度為10%-80%,。e.應在37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。f.在起始的2天中盡量減少振蕩,，以防止剛貼壁的細胞發(fā)生脫落,，漂浮。g.待細胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀,，應將原代細胞換液,。h.用骨髓或外周血中的懸浮細胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時，應將細胞懸液經(jīng)低速離心后換液,。

原代細胞培養(yǎng)實驗室常規(guī)步驟為：1）將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌,、細菌、等污染源,，這些污染源將會所需培養(yǎng)的原代細胞凋亡,、停止生長和繁殖直至死亡，因此整個原代細胞培養(yǎng)過程中較全在無菌狀態(tài)下進行,。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘,，通常在37C水浴里進行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型,，比如成骨,、肌肉、心,、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞,，但是對于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶,，以免損傷分散出來的單個細胞,。3）將分散而成的單個細胞置于合適的培養(yǎng)基（含有特殊細胞生長因子、添加劑以及血清,，或者無血清培養(yǎng)基）中培養(yǎng),，使細胞得以生存、生長和繁殖,，整個過程都是在無菌情況下操作用專門的原代細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng),，較大限度提高原代細胞的生長。

原代細胞培養(yǎng)問題：1,、細胞培養(yǎng)過程中,，多久更換一次培養(yǎng)基這取決于細胞生長的速度。一般而言2-3天更換一次培養(yǎng)基,，許多細胞培養(yǎng)實驗室通常在周一,，周三，周五更換培養(yǎng)基,。注意：凍存細胞復蘇后,，在6-16小時內(nèi)更換培養(yǎng)基,，以去除殘留的二甲基亞楓和死亡的細胞。2,、我能擴增培養(yǎng)和再次凍存原代正常人類細胞嗎,？這取決于細胞的類型。一些細胞類型像神經(jīng)細胞,，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和一些生長緩慢的上皮細胞,，不推薦擴增培養(yǎng)和再次凍存。其它的細胞類型像成纖維細胞,、星形細胞,、腎系膜細胞、星形膠質(zhì)細胞等等,，可以擴增培養(yǎng)和再次凍存,。然而，需要注意的是再次凍存的過程可能導致細胞生長性能的改變,。3,、培養(yǎng)瓶中應該加入多少體積的培養(yǎng)基？我們推薦的用量為：T-25培養(yǎng)瓶5ml,，T-75培養(yǎng)瓶15ml,，T-150培養(yǎng)瓶30ml。用70％的酒精沖洗凍存管,，然后擦去多余酒精,。杭州濟南原代細胞分離試劑盒

加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來,。重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒哪里買

原代細胞的小知識：1.解凍原代細胞對解凍過程非常敏感,，因此將小瓶置于37℃水浴鍋中，保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的,。然后應立即從水浴中取出小瓶,，并轉(zhuǎn)移到無菌操作臺。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準備就緒,，以便可以立即用于接種細胞,，并置于培養(yǎng)箱中，我們在使用cellsystems的原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞時,，復蘇的時候沒有去離心,，第二天換個液就可以。2.傳代原代細胞有間隙克制接觸不良反應,，所以細胞不能到達100%的密度的時候傳代,，一般較有效的建議觀察細胞的生長周期，CellSystems的原代細胞在細胞密度達到85%左右的時候傳代較佳,，當生長至100％匯合時,，它就會衰老,。記住，所有的原代細胞不是100％純,，因此我們要盡量減少污染細胞的生長,。當細胞傳代時，使用低濃度的胰蛋白酶,，也可以嘗試下cellsystems的整體消化套裝哦（品牌：cellsystems，貨號：4Z0-800）并在顯微鏡下密切監(jiān)測細胞,。此外,，記得在胰蛋白酶消化后完全中和細胞中的胰酶，因為任何活性的胰蛋白酶都將損傷細胞重慶正規(guī)原代細胞分離試劑盒哪里買