細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.準備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候,，在開展正式實驗前要多做預試驗,，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量,、DNA密度,、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等,。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候,，如果電壓太大,，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況。不同的細胞,，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗,，多摸索條件,。對于大多數(shù)細胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進行轉(zhuǎn)染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是較強的,。細胞濃度應該處于5x106到1x107／mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應該控制在4-6μg，如果﹥10μg,，轉(zhuǎn)染效率也較大降低,。使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。無錫細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗原理外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法,、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導法和細菌介導法,。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;細菌法是利用包裝了外源基因的細菌傳染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴,、難度較大;細菌法的前期準備較復雜,、而且可能對于細胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法~無錫細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好細胞易于生長到高密度并合成更多蛋白,。

如何有效提高細胞轉(zhuǎn)染實驗效率：1.選擇高效的轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法,，但大多大同小異。轉(zhuǎn)染時應跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法,，但也要注意,，因不同實驗室培養(yǎng)的細胞性質(zhì)不同，質(zhì)粒定量差異,，操作手法上的差異等,，其轉(zhuǎn)染效果可能不同，應根據(jù)實驗室的具體條件來確定較佳轉(zhuǎn)染條件,。2.確保所構建載體的質(zhì)量,。轉(zhuǎn)染載體的構建（細菌載體，質(zhì)粒DNA,，RNA,，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果,。細菌載體對特定宿主細胞傳染效率較高,，但不同細菌載體有其特定的宿主,，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄細菌需侵染分裂期的宿主細胞,，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）,。除載體構建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響,。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進行,，因此選擇組成或可調(diào)控,，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾,。

細胞轉(zhuǎn)染,，你至少要掌握以下幾點：胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術,。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展,，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能,、調(diào)控基因表達,、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學試驗中，其應用越來越普遍,?？煞譃樗矔r轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染等,。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達,，但通常只持續(xù)幾天,，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說,，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,，在轉(zhuǎn)染后24-72h內(nèi)分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,，β半乳糖苷酶等來幫助檢測,。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體存在,。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高,。外源DNA整合到染色體中概率很小，通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細胞密度而異,。

DNA細胞轉(zhuǎn)染步驟：1.提前現(xiàn)在細胞鋪板提前現(xiàn)在將細胞種植在24孔板中,，以轉(zhuǎn)染時細胞密度在60％左右為宜。2.轉(zhuǎn)染過程⑴將0.8μg的DNA用25μl無血清稀釋液稀釋,，充分混勻,，制成DNA稀釋液。注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM,、無血清DMEM或1640,。⑵將2μlEntransterTM-H4000用25μl無血清稀釋液體稀釋，充分混勻,，制成EntransterTM-H4000稀釋液。室溫靜置5分鐘,。⑶將EntransterTM-H4000稀釋液分別加入到DNA稀釋液中,，充分混勻（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上），室溫靜置15分鐘,。轉(zhuǎn)染復合物制備完成,。⑷將轉(zhuǎn)染復合物加入到含細胞和完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器上，輕柔混勻,。注意：①對本試劑,，采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。②完全培養(yǎng)基可加物品,。細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素,。廈門細胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價

轉(zhuǎn)染試劑與細胞不匹配細胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細胞。無錫細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好

細胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異,。因轉(zhuǎn)染試劑對細胞有毒害作用,，細胞太少，容易死,。一般轉(zhuǎn)染時,，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,，確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期,。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量,。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性,。同其他啟動子,，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系,，如Jurkat中組成表達水平較低,。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子,。無錫細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家好