穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響,。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí),，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基,，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等,，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線,，確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時(shí)間,，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下,，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次,。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品，一般是篩選劑量的一半,。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆,，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌梢苑謩e純化（克?。?，收集進(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。一般轉(zhuǎn)染時(shí),，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時(shí)效果較好,。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長(zhǎng)滿或處于靜止期,。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要,。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量,。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的，CAT活性也較高,。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了,。這些結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑的量會(huì)因細(xì)胞密度而異~濟(jì)南正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家批發(fā)價(jià)蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系合成可溶的,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：人工脂質(zhì)體法原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物,，進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時(shí)性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞,，轉(zhuǎn)染效率高,、重復(fù)型好，但轉(zhuǎn)染時(shí)需要去除血清,，轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大,。實(shí)驗(yàn)步驟：在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合，形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或沉默情況,。

如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細(xì)胞核的核膜（"核屏障"）,。在細(xì)胞有絲分裂過程中核膜溶解，DNA進(jìn)入細(xì)胞核才有可能,。為此,，細(xì)胞處于分裂期對(duì)DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的，并且處于分裂期的細(xì)胞比例必須盡可能大才能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,。DNA轉(zhuǎn)染機(jī)制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的,，因?yàn)镽NA不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),，因此細(xì)胞分裂對(duì)它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實(shí)驗(yàn)如虎添翼,！真核細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng),，使它們能夠檢測(cè)外來(lái)物質(zhì)如脂多糖、細(xì)菌或細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì),，并克制潛在病原體的入侵,。此外,，細(xì)胞通過信使分子向臨近細(xì)胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號(hào),。因此，這些臨近細(xì)胞甚至無(wú)需接觸病原體即可采取防御方式,。這種細(xì)胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個(gè)障礙,。瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測(cè)到,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞,。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,。這時(shí)候可以選擇Entranster轉(zhuǎn)染試劑,，非脂質(zhì)體試劑，培養(yǎng)基可加物品,，避免了細(xì)胞染菌,。2.設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。3.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。4.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等,。通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要,。南京北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（很長(zhǎng)轉(zhuǎn)染）,。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：物品(PS)物品,，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品,。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤(rùn)洗細(xì)胞,。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競(jìng)爭(zhēng)性克制劑,。另外,，為了保證無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長(zhǎng)，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量,。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家供應(yīng)