細胞轉染之PEI轉染法：1.細胞分盤：通過胰酶消化收集細胞，用適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于35mm培養(yǎng)皿上（根據(jù)實驗需要選擇培養(yǎng)皿，使細胞貼壁后所占面積達到培養(yǎng)皿總面積的70－90％）。將細胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,，當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前2h換液（用1.5ml無血清培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）,。注：PEI轉染法對細胞生長有克制作用,，在換液前細胞幾乎不生長，所以需要密度比較大時做轉染,。2.制備PEI-DNA混合物以35mm組織培養(yǎng)皿用240μl反應總體積為例,。先在無菌EP管中加入120μl1×HBS,再加入質粒DNA（總量1-3μg為佳），混勻后加入等體積PEI工作液,，充分混勻后室溫靜置20-30min,，較后將這240μl的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育,。轉染 ,，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。上海開封細胞高效轉染試劑

如何有效提高細胞轉染實驗效率：1.選擇合適的轉染試劑不同細胞系轉染效率通常不同,，但細胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要,，因此在轉染實驗前應根據(jù)實驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。每種轉染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉染的細胞株列表和文獻,，通過這些資料可選擇較適合實驗設計的轉染試劑,。當然，較適合的是高效,、低毒,、方便、廉價的轉染試劑,。2.保持較佳的細胞狀態(tài)一般低的細胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔儭］^適合轉染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到指數(shù)生長期的細胞,，細胞生長旺盛,，較容易轉染。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總染色體重組或基因調控變化等而演化,。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。也就是說同一種系的細胞株,，在各實驗室不同培養(yǎng)條件下,，其生物學性狀發(fā)生不同程度的改變，導致其轉染特性也發(fā)生變化,。因此,，如果發(fā)現(xiàn)轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果,。合肥細胞高效轉染試劑哪家好能與核酸的磷酸根通過靜電作用,，將DNA分子包裹入內。

轉染的注意事項：培養(yǎng)基中的物品物品,，比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導致轉染效率低,。所以，在轉染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品,。這樣，在轉染前也不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量,。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總染色體重組或基因調控變化等而演化,，這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性,。比如,，新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉染效率，融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率,。因此,，如果觀察到轉染效率降低，可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果

細胞轉染那些事兒：1.設置陰性和陽性對照：一般在轉染后24-48h,靶基因即在細胞內表達,?？梢罁?jù)不同的實驗目的，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測等實驗,。2.轉染后效率的檢測方法：觀察轉染后細胞熒光情況,；qPCR驗證；WB檢測敲減或過表達蛋白,。3.轉染效率低,，可采取以下兩種方法：1)復轉染，即轉染后12-24h再進行轉染,，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好,，轉染后細胞死亡數(shù)較少。2)通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞,，前提是該質粒帶有物品抗性的基因,。4.電轉時，不同的細胞需要的電壓是不一樣的,，需要做預實驗,，摸索較佳條件。對于大多數(shù)細胞而言,，較佳電壓位于250-1250v/cm,。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10min,使細胞恢復損傷,。是目前實驗室較方便的轉染方法之一,，其轉染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法,。

細胞轉染實驗注意事項：1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞,。這降低了細胞的活性，導致轉染效率降低,。這時候可以選擇Entranster轉染試劑,，非脂質體試劑，培養(yǎng)基可加物品,，避免了細胞染菌,。2.設置陽性對照和陰性對照,。3.一般在轉染24-48h，靶基因即在細胞內表達,。根據(jù)不同的實驗目的,，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。4.如若建立穩(wěn)定的細胞系,，則可對靶細胞進行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,，常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等,。瞬時轉染后，可在48h-72h細胞長滿之后,，提取細胞蛋白或者RNA,。上海開封細胞高效轉染試劑

轉化、轉染,、轉導幾個名詞是從事生命科學研究的初學者經(jīng)常碰到的,。上海開封細胞高效轉染試劑

細胞轉染的常用方法：人工脂質體法原理：帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物，進而可被細胞內吞穩(wěn)定轉染/瞬時性轉染,。這種方法幾乎適用于所有細胞,，轉染效率高、重復型好,，但轉染時需要去除血清,，轉染效果隨細胞類型變化大。實驗步驟：在單獨試管中分別稀釋核酸及轉染試劑→脂質體與核酸的磷酸骨架結合,，形成復合物→脂質體上的正電荷有助于復合物與細胞膜結合→復合物通過內吞作用進入胞漿→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況,。上海開封細胞高效轉染試劑