細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有毒害作用,，細(xì)胞太少,，容易死,。一般轉(zhuǎn)染時,，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml,，確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期,。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量,。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性,。同其他啟動子,，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高,。這三種細(xì)菌啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系,，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子,，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子,。是目前實驗室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高,，優(yōu)于磷酸鈣法,。昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率影響因素：1.細(xì)胞密度一般來說，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以取得較高的轉(zhuǎn)染效率,，過低或過高都會影響轉(zhuǎn)染效果,。2.細(xì)胞生長狀態(tài)這點非常關(guān)鍵，很多時候傳代次數(shù)太少或者太多都將導(dǎo)致細(xì)胞對轉(zhuǎn)染試劑敏感度的改變。因此,，為了提高轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染穩(wěn)定性,、降低細(xì)胞毒性，應(yīng)盡量使用適度傳代的細(xì)胞系,，并在不同次實驗時保持細(xì)胞傳代次數(shù)的一致性,。3.細(xì)胞種類不同細(xì)胞種類的細(xì)胞在做轉(zhuǎn)染時所需要的轉(zhuǎn)染體系是不同的，不能一種體系用在所有類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗,。開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,，外源基因得以表達(dá)但它們并不會整合到細(xì)胞的基因組中。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.不注意細(xì)節(jié)在轉(zhuǎn)染之前更換一次37℃預(yù)溫的培養(yǎng)基,，可提高轉(zhuǎn)染效率,。脂質(zhì)體和DNA/RNA混合物應(yīng)當(dāng)一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊,，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿,，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細(xì)枝末節(jié),，但是,，如果不注意的話，也會造成轉(zhuǎn)染效率低下,。2.細(xì)胞狀態(tài)不好細(xì)胞狀態(tài)不好,，會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。一般進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期,。如果是貼壁細(xì)胞的話,，貼壁率應(yīng)該在70-80%；如果是懸浮細(xì)胞的話,，應(yīng)該是6X105個/孔（24孔板）,，一般是轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在換液，轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基或PBS洗細(xì)胞一次,。轉(zhuǎn)染的整個過程都不應(yīng)該有物品。

影響轉(zhuǎn)染試驗的因素：細(xì)胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,，也不是傳代很多次的細(xì)胞,。這是因為細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛,，較容易轉(zhuǎn)染,。（2）把握時機沒錯,！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA,。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài),，如細(xì)胞數(shù)量過多,，互相疊加，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭,，代謝廢物積聚,，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的！震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn),，原來是Lipofectamine2000過期了,。換了之后，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗,，盡量使用開封半年內(nèi)的,，因為過了半年后,，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降,。千萬不要為了省錢，影響實驗進(jìn)度哈,。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,，會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,，較好不要換液,，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清,。過早的話,，會引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長。那么,，什么是較佳時機呢,？在20%的細(xì)胞變圓的時候，就是加血清的較佳時機,。細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。開封細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷廠家

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中。昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

如何有效提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗效率：1.選擇高效的轉(zhuǎn)染方法不同轉(zhuǎn)染試劑有不同的轉(zhuǎn)染方法,，但大多大同小異,。轉(zhuǎn)染時應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法，但也要注意,，因不同實驗室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同,，質(zhì)粒定量差異，操作手法上的差異等,，其轉(zhuǎn)染效果可能不同,，應(yīng)根據(jù)實驗室的具體條件來確定較佳轉(zhuǎn)染條件。2.確保所構(gòu)建載體的質(zhì)量,。轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（細(xì)菌載體,，質(zhì)粒DNA，RNA,，PCR產(chǎn)物,，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。細(xì)菌載體對特定宿主細(xì)胞傳染效率較高,，但不同細(xì)菌載體有其特定的宿主,，有的還要求特定的細(xì)胞周期，如逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染）,。除載體構(gòu)建外，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響,。如果基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性作用，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,，因此選擇組成或可調(diào)控,，強度合適的啟動子也很重要，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾,。昆明細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家