轉(zhuǎn)染的注意事項:細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時,,貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時效果較好,。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期,。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量,。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的,CAT活性也較高,。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了,。這些結(jié)果說明,對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細(xì)胞密度而異對于貼壁細(xì)胞,,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,,用胰酶處理為單細(xì)胞懸液。重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價
轉(zhuǎn)染的注意事項:用于蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行,。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達(dá)蛋白,,因為血清蛋白會干擾下游表達(dá)蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細(xì)胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清,,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養(yǎng)基低得多),。無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分,。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應(yīng)用的一種,。在含血清時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,無蛋白培養(yǎng)基或限定化學(xué)成分的培養(yǎng)基,。在部分情況下(如293-F,,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細(xì)胞,,可以使用其培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染,。其他一些無血清培養(yǎng)基包含克制陰離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的成分,在這些情況下,,有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染溫州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家在現(xiàn)生命可續(xù)研究中,,大部分的工作是利用基因功能研究來探索生命過程。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑:1.準(zhǔn)備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候,,在開展正式實驗前要多做預(yù)試驗,,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括:脂質(zhì)體的用量,、DNA密度,、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等,。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候,,如果電壓太大,往往會發(fā)生細(xì)胞大量死亡的情況,。不同的細(xì)胞,,需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實驗,,多摸索條件,。對于大多數(shù)細(xì)胞來說,其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,,就是進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細(xì)胞的抗損傷能力是較強(qiáng)的,。細(xì)胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107/mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6μg,如果﹥10μg,,轉(zhuǎn)染效率也較大降低,。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作方法:轉(zhuǎn)染,是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。隨著基因與蛋白功能研究的深入,,轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo),、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑,。電穿孔法、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例,;化學(xué)介導(dǎo)方法很多,,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù),;生物介導(dǎo)方法,,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點,。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),,是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,同時具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢,。但是,,細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,,在一般實驗室中很難普及,。瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)根據(jù)基因表達(dá)時間的長短可分為兩大類。
影響轉(zhuǎn)染試驗的因素:細(xì)胞狀態(tài)變化:(1)轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,,也不是傳代很多次的細(xì)胞,。這是因為細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞,,細(xì)胞生長旺盛,,較容易轉(zhuǎn)染。(2)把握時機(jī)沒錯,!轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機(jī),,相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,,細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板,。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài),如細(xì)胞數(shù)量過多,,互相疊加,,營養(yǎng)物質(zhì)耗竭,代謝廢物積聚,,轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的,!其可降解性對體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。溫州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家
形成DNA脂復(fù)合物,,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,。重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價
影響轉(zhuǎn)染試驗的因素:1.轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系不匹配轉(zhuǎn)染試劑跟細(xì)胞系也是講究配合默契的,使用同一種試劑,不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同,。但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要,,因此在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑。每種轉(zhuǎn)染試劑都會提供一些已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株列表和文獻(xiàn),,通過這些資料可選擇較適合實驗設(shè)計的轉(zhuǎn)染試劑,。當(dāng)然,較適合的是高效,、低毒,、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑,。因為有些細(xì)胞系是不穩(wěn)定的,,可能隨著培養(yǎng)時間的改變,培養(yǎng)條件的不同,,不同的選擇壓力,,可能引起不同的克隆選擇。因此就算是同一個細(xì)胞系,,在不同條件下轉(zhuǎn)染能力的差異可能會很大,。重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價