鼠尾膠原包被培養(yǎng)板：胎干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而形成血管,因而成為血管組織工程理想的種子細(xì)胞來(lái)源之一,。目的:探討建立定向誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法。方法:在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞H1,將H1細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到鼠尾膠原包被的培養(yǎng)板,貼壁24-48h后,培養(yǎng)基換為含不同輔助因子和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基,。結(jié)果與結(jié)論:①在EGM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,細(xì)胞逐步表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記基因VEGFR-2,、PECAM1、vWF,、CD34、VE-cadherin,、GATA-2,。②分化細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記VE-cadherin、CD31,。③分化細(xì)胞具有吞噬低密度脂蛋白功能。說(shuō)明將人胚胎干細(xì)胞接種在鼠尾膠原包被培養(yǎng)板上,通過(guò)EGM-2內(nèi)皮培養(yǎng)體系誘導(dǎo),可直接分化為功能性血管內(nèi)皮細(xì)胞,。為研究胞外基質(zhì)對(duì)誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用以及相關(guān)信號(hào)分子機(jī)制打下了基礎(chǔ),。在操作過(guò)程中要盡量保持低溫。保存條件4℃保存,，切勿凍存,，有效期一年,。杭州正規(guī)鼠尾膠原

一種生物醫(yī)用鼠尾膠原蛋白的提取方法：1.用0.03?0.06mol/L的檸檬酸溶液溶解沉淀物,，成透明澄清黏稠溶液；在冰水浴中,，調(diào)節(jié)pH=6.5，用的3?6mol/L的NaCl溶液緩慢加入上清液中,，不斷攪拌至溶液中白色的絮狀物不再析出,，4°C沉淀10小時(shí)，去除上清液,，去除上清液，絮狀溶液高速冷凍離心處理,，收集沉淀,；2.用0.03?0.06mol/L的檸檬酸再次溶液溶解沉淀物，成透明澄清黏稠溶液,，冰水浴中，調(diào)節(jié)PH=6.5;溶液依次通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂,、陰離子交換樹脂進(jìn)行脫鹽處理,；(8)將脫鹽后的膠原蛋白溶液，-40至-20°C預(yù)凍2?4小時(shí),，然后真空冷凍干燥,，凍干產(chǎn)品經(jīng)進(jìn)一步處理得到含水率在3%以下的膠原蛋白微粉，滅菌,、包裝，得到成品膠原蛋白粉末,。杭州正規(guī)鼠尾膠原鼠尾膠原醋酸溶解：按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶,。

鼠尾膠原備用膠凝程序：1）在冰上放置以下物品：膠原蛋白I、無(wú)菌10×PBS,、無(wú)菌蒸餾水、無(wú)菌1MNaOH,。2）確定膠原蛋白I待使用溶液所需的較終濃度的體積,。3）在冰上放置無(wú)菌管以收存膠原蛋白I。4）在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下步驟,。4.1加入10×PBS（終體積/10）mL4.2計(jì)算要使用的膠原蛋白I的體積（不要添加到管中直到步驟4.6為止）終體積x終膠原蛋白I濃度（mg/mL）,。4.3向10×PBS溶液中加入（要加入的膠原體積×0.023）mL的無(wú)菌冰冷1MNaOH,。4.4向4.3溶液中加入下述體積的無(wú)菌冰冷蒸餾水：添加蒸餾水體積=V（終）—V（膠原蛋白）—V(10×PBS）—V（1MNaOH）4.5混合管中的物質(zhì)并放入冰中,。4.6加入膠原蛋白I并計(jì)算體積，混勻,，冰上備用,。5）膠原蛋白I溶液可立即使用或在冰上放置2-3小時(shí)。6）使用時(shí),，無(wú)菌條件下將溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)裝置中37°C凝膠30min。

要準(zhǔn)備的器具：組織剪2把,，有齒鑷1把,，無(wú)齒鑷1把，200ml燒杯1個(gè),，培養(yǎng)皿1個(gè)，帶蓋廣口瓶1個(gè),，離心管,、小瓶數(shù)個(gè)，滴管若干,。以上物品須經(jīng)嚴(yán)格高壓消毒滅菌,。需配制的液體0.1％醋酸溶液,。經(jīng)44.48N10min高壓蒸汽滅菌(或是過(guò)濾除菌)后備用。此外還有用消毒雙蒸水配制75％酒精溶液,。取大鼠尾巴,，洗凈，置75%酒精浸泡消毒后,，手持尾巴,，用止血鉗夾住尾巴較高，折斷尾骨后拉出尾腱,，將尾腱剪碎后置消毒的三角燒瓶中,，稱尾腱的重量,，按每克尾腱50ml的比例加入0.1%醋酸溶液,，搖晃，使尾腱分散于醋酸溶液中,，4℃放置48小時(shí),，離心。吸取其上清,，分裝至小瓶,，4℃保存。上述制備過(guò)程均在無(wú)菌條件下完成,。整個(gè)操作請(qǐng)?jiān)跓o(wú)菌環(huán)境下無(wú)菌操作,，避免污染以影響細(xì)胞生長(zhǎng),。

膠原蛋白的提取方法：酸法提取：酸法提取主要采用低離子濃度酸性條件浸漬處理原料,，從而破壞分子間的鹽鍵和希夫堿,，而引起纖維膨脹、溶解,。作為溶劑使用的酸，主要有鹽酸或亞硫酸,、磷酸,、硫酸、醋酸,、檸檬酸和甲酸等。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法,，用酸法提取的膠原較大程度地保持了其三股螺旋結(jié)構(gòu),。此法處理快速，所得產(chǎn)品的分子量是連續(xù)的,，適用于醫(yī)用生物材料及原料的制備,，但產(chǎn)品得率低,，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，污染重,。趙蒼碧等[2]采用0.3%的醋酸溶液在4℃下從牛腱中提取膠原蛋白,，得到高純度的膠原蛋白溶液,。鼠尾膠原醋酸溶解：將鼠尾膠原加入到0.1M的醋酸中。廈門正規(guī)鼠尾膠原廠家直銷

結(jié)論鼠尾膠原能促進(jìn)毛細(xì)胞貼壁,。杭州正規(guī)鼠尾膠原

I型鼠尾膠原是借鑒NavneetaRajan,JasonHabermehl法，經(jīng)過(guò)乙酸抽提,、離心,、滅菌、透析等步驟制備得到的高純度,、高活性膠原蛋白，屬于醫(yī)藥級(jí)別產(chǎn)品,，可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿（單分子層包被）,，適合多種類型細(xì)胞的貼壁如肝臟細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,、胚胎細(xì)胞,、肌細(xì)胞,、肺細(xì)胞、神經(jīng)鞘細(xì)胞等,。I型膠原蛋白包被細(xì)胞培養(yǎng)板,，規(guī)格為6/24孔板，表面經(jīng)I型膠原蛋白包被,，可以很好的降低蛋白質(zhì)的吸附,。使用這種細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞,，可以獲得良好的細(xì)胞貼壁率，細(xì)胞增殖速度快,，形態(tài)均一,，細(xì)胞培養(yǎng)成功率高。杭州正規(guī)鼠尾膠原