細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1. 細(xì)胞污染細(xì)胞污染也是造成細(xì)胞死亡,，轉(zhuǎn)染效率低下的一大原因。首先,，轉(zhuǎn)染細(xì)胞用的質(zhì)粒必須保證無菌,。而現(xiàn)在市場上的一般的質(zhì)粒提取試劑盒都做不到較全無菌。毛博這里再貢獻(xiàn)一個獨(dú)門絕招：將提完質(zhì)粒后或者提的較后一步,，用75％乙醇沉淀,，這樣就除菌了。2.質(zhì)粒不行轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒首先要保證數(shù)量,，一般為2 μg以上。質(zhì)粒純度不夠或者含有細(xì)菌LPS或其他對細(xì)胞有毒害作用的物質(zhì),，也會影響轉(zhuǎn)染效率,。這個時候，就應(yīng)該對質(zhì)粒進(jìn)行純化和濃縮,。震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑服務(wù)電話

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同 的,。較好是在靠前次實(shí)驗(yàn)前做一個預(yù)實(shí)驗(yàn),，比如：HeLa,，293，CHO,，COS7,， MCF－7，HepG2等細(xì)胞,，是否加血清,，對不同的細(xì)胞是有不同的影響的，有些細(xì)胞是可以有血清的,，有些加血清就會受影響,。轉(zhuǎn)染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性作用大,，其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡,。轉(zhuǎn)染時不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時加入,。加入過早會引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢生長,，過晚會引起較多細(xì)胞死亡?？蓪?shí)時觀察1/5細(xì)胞變圓的時候加入血清,。無錫廣州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（很長轉(zhuǎn)染）,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染之PEI 轉(zhuǎn)染法：1.細(xì)胞分盤：通過胰酶消化收集細(xì)胞,，用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基以 1×105 至 4×105細(xì)胞/cm2 的密度平鋪細(xì)胞于 35 mm 培養(yǎng)皿上（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到培養(yǎng)皿總面積的 70－90％）,。將細(xì)胞置于含 5％CO2 的 37℃溫箱中孵育 8-24 h,，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前 2 h 換液（用 1.5 ml 無血清培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基）,。注：PEI轉(zhuǎn)染法對細(xì)胞生長有克制作用,，在換液前細(xì)胞幾乎不生長，所以需要密度比較大時做轉(zhuǎn)染,。2.制備PEI-DNA 混合物以 35 mm 組織培養(yǎng)皿用 240 μl 反應(yīng)總體積為例,。先在無菌EP管中加入120 μl 1×HBS,再加入質(zhì)粒 DNA（總量 1-3 μg 為佳），混勻后加入等體積 PEI工作液,，充分混勻后室溫靜置 20-30 min ,，較后將這 240 μl 的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動平皿混勻后置于含 5％ CO2的 37℃溫箱孵育,。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：(1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。B.震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,，。(2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩,。(3)將混合液在室溫放置10—15分鐘。(4)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。(5)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。(6)到時后,，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時,。因?yàn)镈NA攝入效率和表達(dá)水平在不同實(shí)驗(yàn)中差異較大,，實(shí)驗(yàn)必須很小心。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.如為貼壁生長細(xì)胞,，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,，必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%（貼壁細(xì)胞）或2×106-4×106細(xì)胞/ml（懸浮細(xì)胞）為宜,，較好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),，無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染,，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。3.培養(yǎng)基中的血清在開始準(zhǔn)備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基,，因?yàn)檠鍟绊憦?fù)合物的形成,。其實(shí)，只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清,，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的,。加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。徐州北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異,。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑服務(wù)電話

由于精細(xì)化學(xué)品的難以替代性，其應(yīng)用范圍不斷向縱深擴(kuò)張,，原代細(xì)胞,，無血清細(xì)胞凍存液,，干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基,，動物疾病模型飛速發(fā)展已成為化工行業(yè)發(fā)展必然趨勢,。近十多年來，我國重視精細(xì)化學(xué)品行業(yè)的發(fā)展,，把精細(xì)化學(xué)品作為化學(xué)工業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略重點(diǎn)之一,。精細(xì)化工中間體產(chǎn)品**性強(qiáng)，需要建立特定銷售渠道,，能否與客戶保持長期業(yè)務(wù)合作,，將對生產(chǎn)型企業(yè)日常經(jīng)營和長遠(yuǎn)發(fā)展構(gòu)成重大影響。精細(xì)化工中間體的質(zhì)量和純度直接影響到終端產(chǎn)品的性能和品質(zhì),。此外,，由于發(fā)達(dá)地區(qū)人力成本高，超過**保護(hù)期的農(nóng)藥原藥和醫(yī)藥原料藥已無生產(chǎn)優(yōu)勢,，以中國與印度為象征的發(fā)展中國地區(qū)逐漸成為農(nóng)藥,、醫(yī)藥中間體和銷售的主要生產(chǎn)基地。與基礎(chǔ)化工行業(yè)相比,，精細(xì)化工行業(yè)主要生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品,，是在基礎(chǔ)化學(xué)品的基礎(chǔ)上深加工的產(chǎn)物，行業(yè)內(nèi)產(chǎn)品覆蓋了社會生活的各個方面,，從涂料,、電子、油墨,、醫(yī)藥,、造紙、食品添加劑等,，到航空航天,、汽車、機(jī)械,、建筑新材料,、新能源技術(shù)等高新技術(shù)方面均得到非常普遍的應(yīng)用，在國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中起到了不可替代的作用,。由于精細(xì)化工產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟(jì),、地區(qū)產(chǎn)業(yè)中的重要作用，其發(fā)展程度也被視為地區(qū)戰(zhàn)略發(fā)展的重要部分,。南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑服務(wù)電話

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