細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無(wú)毒,，但陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低,。這時(shí)候可以選擇Entranster轉(zhuǎn)染試劑，非脂質(zhì)體試劑,，培養(yǎng)基可加物品,，避免了細(xì)胞染菌。2.設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。3.一般在轉(zhuǎn)染24-48h,，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?4-48h后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。4.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選,，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等,。大部分外源DNA會(huì)被核酸酶降解或隨細(xì)胞分裂而稀釋,。無(wú)錫南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：不同的細(xì)胞及轉(zhuǎn)染試劑要求轉(zhuǎn)染的條件是不同 的。較好是在靠前次實(shí)驗(yàn)前做一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn),，比如：HeLa,，293，CHO,，COS7,， MCF－7，HepG2等細(xì)胞,，是否加血清,，對(duì)不同的細(xì)胞是有不同的影響的，有些細(xì)胞是可以有血清的,，有些加血清就會(huì)受影響,。轉(zhuǎn)染后在6小時(shí)左右較好換液且換為有血清的培養(yǎng)基，其一因?yàn)槠胀ㄞD(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用大,，其二可降低因血清的缺乏引起的細(xì)胞的死亡,。轉(zhuǎn)染時(shí)不加血清是防止血清的干擾作用，轉(zhuǎn)染后可適時(shí)加入,。加入過(guò)早會(huì)引起未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),，過(guò)晚會(huì)引起較多細(xì)胞死亡?？蓪?shí)時(shí)觀察1/5細(xì)胞變圓的時(shí)候加入血清,。蘇州正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑平均價(jià)格轉(zhuǎn)染 ，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù),。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：生長(zhǎng)的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響,。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時(shí),，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,，保證在開始篩選時(shí)可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)倒掉培養(yǎng)基,，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。因?yàn)樵S多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,，包括細(xì)胞類型,，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對(duì)每種細(xì)胞作一個(gè)劑量反應(yīng)曲線,，確定較佳濃度,。篩選較多可能需要一周時(shí)間,，因?yàn)樵谥滤绖┝康腉ENETICIN物品存在條件下,，細(xì)胞會(huì)分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)使用較低劑量的物品,，一般是篩選劑量的一半,。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，可以分別純化（克?。占M(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計(jì)數(shù),。

如何提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率：1.組織培養(yǎng)試劑優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)條件,。只使用新鮮配制的培養(yǎng)基和添加劑，并經(jīng)可能減少所用試劑的變更,?；A(chǔ)培養(yǎng)基—目前所使用的各種市售培養(yǎng)基(如，RPMI 1640和DMEM),。培養(yǎng)基的成分包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸,，葡萄糖)，維生素,，無(wú)機(jī)鹽,，和緩沖物質(zhì)。有些成分非常不穩(wěn)定,，因此如果不在使用時(shí)新鮮加入就可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題,。務(wù)必要使培養(yǎng)基避光保存。因?yàn)橐阎幸恍┙M分和緩沖物質(zhì),，如HEPES,，當(dāng)暴露于光照下就會(huì)分解產(chǎn)生細(xì)胞毒性物質(zhì)。另外,，血清,，添加劑，來(lái)自于培養(yǎng)箱內(nèi)的污染物,、化學(xué)物質(zhì),，或/細(xì)胞的污染也都可能影響到細(xì)胞生理。2.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)密切觀察您的細(xì)胞;確保它們狀態(tài)良好。在開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞之前,，先制定一個(gè)適當(dāng)?shù)姆N板方案,，使細(xì)胞密度從轉(zhuǎn)染開始到結(jié)束都保持較佳狀態(tài)。增加成功幾率—細(xì)胞是轉(zhuǎn)染過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵元素,，它可以是影響結(jié)果的一致性和質(zhì)量的較重要的變量,。直到外源基因在細(xì)胞分裂過(guò)程中因各種因素丟失為止。

影響轉(zhuǎn)染試驗(yàn)的因素：細(xì)胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,，也不是傳代很多次的細(xì)胞,。這是因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,，較容易轉(zhuǎn)染,。（2）把握時(shí)機(jī)沒(méi)錯(cuò)！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī),，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA,。因此對(duì)大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板,。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過(guò)度生長(zhǎng)的狀態(tài),，如細(xì)胞數(shù)量過(guò)多，互相疊加,，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭,，代謝廢物積聚，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的,！加入混合液,，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。杭州石家莊細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

在轉(zhuǎn)染過(guò)程中是可以使用血清的,。無(wú)錫南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

如何高效率實(shí)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞胞漿內(nèi)的DNA 不能穿過(guò)細(xì)胞核的核膜（"核屏障"）,。在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中核膜溶解，DNA進(jìn)入細(xì)胞核才有可能,。為此,，細(xì)胞處于分裂期對(duì)DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的，并且處于分裂期的細(xì)胞比例必須盡可能大才能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,。DNA轉(zhuǎn)染機(jī)制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對(duì)于RNA轉(zhuǎn)染是沒(méi)有"核屏障"的,，因?yàn)镽NA不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因此細(xì)胞分裂對(duì)它沒(méi)有影響,。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實(shí)驗(yàn)如虎添翼,！真核細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng),，使它們能夠檢測(cè)外來(lái)物質(zhì)如脂多糖、細(xì)菌或細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì),，并克制潛在病原體的入侵,。此外，細(xì)胞通過(guò)信使分子向臨近細(xì)胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號(hào),。因此,，這些臨近細(xì)胞甚至無(wú)需接觸病原體即可采取防御方式。這種細(xì)胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個(gè)障礙,。無(wú)錫南昌細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑