細胞轉染實驗簡介實驗步驟：1,、細胞傳代(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球,，廢液缸,，試管架，微量移液器,，記號筆,，培養(yǎng)皿,，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基,，用1ml的PBS溶液洗滌兩次,。(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37,。C,，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁,，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止,。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。(5)用頭多次吹吸,，使細胞完全分散開,。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min,。(7)用培養(yǎng)液重懸細胞,，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中,，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中,，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，第二天轉染,。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點,。無錫成都細胞高效轉染試劑

細胞轉染的注意事項：轉染是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術,。分為物理介導方法：電穿孔法、顯微注射和基因,；化學介導方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術,；生物介導方法：有較為原始的原生質體轉染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,，應該具有轉染效率高,、細胞毒性小等優(yōu)點。細菌介導的轉染技術,，是目前轉染效率較高的方法,，同時具有細胞毒性很低的優(yōu)勢。但是細菌轉染方法的準備程序復雜,，常常對細胞類型有很強的選擇性,，在一般實驗室中很難普及,。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點,。需要指出的一點,，無論采用哪種轉染技術，要獲得較優(yōu)的轉染結果,，可能都需要對轉染條件進行優(yōu)化,。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型,、細胞培養(yǎng)條件和細胞生長狀態(tài)到轉染方法的操作細節(jié),。無錫成都細胞高效轉染試劑*有一部分轉入細胞的DNA被轉運到細胞核內進行轉錄并較終輸出mRNA到細胞質進行蛋白合成。

細胞轉染效率低下的幾個大坑：1.準備不足做脂質體轉染的時候,，在開展正式實驗前要多做預試驗,，優(yōu)化轉染條件。優(yōu)化轉染條件包括：脂質體的用量,、DNA密度,、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間等等,。2.電壓過大做電轉的時候,，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況,。不同的細胞,，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗,，多摸索條件,。對于大多數(shù)細胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進行轉染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是較強的,。細胞濃度應該處于5x106到1x107／mL之間,。每次轉染的質粒應該控制在4-6 μg，如果﹥10μg,，轉染效率也較大降低,。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘,，使細胞恢復損傷。

細胞轉染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時或穩(wěn)定轉染,。然而因其對pH,、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感,，所得結果容易出現(xiàn)差異，且對許多類型的細胞培養(yǎng)物(尤其是原代細胞)具有細胞毒性,，轉染效率較差,。實驗步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合，同時控制好pH,、溫度等條件 → 室溫孵育,，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀 → 將顆粒型沉淀分散到細胞中，促進DNA粘附在細胞表面 → 共沉淀通過內吞作用進入胞漿 → 分析細胞瞬時基因表達或者選擇穩(wěn)定性傳染,。通過實驗優(yōu)化合適的轉染條件對于轉染效率的提高很重要,。

細胞轉染實驗簡介：實驗原理外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和細菌介導法,。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入;磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;細菌法是利用包裝了外源基因的細菌傳染細胞的方法使得其進入細胞,。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大;細菌法的前期準備較復雜,、而且可能對于細胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系,，一般的瞬時轉染 方法多采用脂質體法。陽離子脂質體轉染試劑脂質轉染試劑,，以其適用宿主范圍廣,。無錫成都細胞高效轉染試劑

建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉染。無錫成都細胞高效轉染試劑

細胞轉染,，你至少要掌握以下幾點：胞轉染是指將外源分子如DNA,，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展,，轉染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具,。在研究基因功能、調控基因表達,、突變分析和蛋白質生產(chǎn)等生物學試驗中,，其應用越來越普遍?？煞譃樗矔r轉染,，穩(wěn)定轉染等。瞬時轉染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,，因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù),，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天,，多用于啟動子和其他調控元件的分析,。一般來說，超螺旋質粒 DNA 轉染效率較高,，在轉染后 24-72 h 內分析結果,，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。穩(wěn)定轉染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中,，也可能作為一種游離體存在,。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小,，通常需要一些選擇性標記反復篩選得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系,。無錫成都細胞高效轉染試劑