數(shù)字PCR系統(tǒng)的分散方式?jīng)Q定了分散數(shù)量，其結(jié)果基于統(tǒng)計的方法進行定量,，增加反應單元數(shù)量（統(tǒng)計樣本量）,，可以增加其檢測的容量和動態(tài)檢測線性范圍達到和qPCR相近的動態(tài)范圍,，同時減小一個反應單元中包含多個分子所造成的誤差，達到提高靈敏度和準確度,。影響dPCR定量結(jié)果的因素包括：儀器采用的分散方式與數(shù)量,、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結(jié)果表達方式,。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定,，分散體積和結(jié)果表達方式需要實驗人員在實驗過程中優(yōu)化得到。dPCR的測量結(jié)果通常表示為含量,，即拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比,，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分數(shù)。臻準數(shù)字PCR試劑盒

在精細診療領域,，患者外周血中的循環(huán)DNA（ctDNA）,，在的早期篩查，圍術期監(jiān)測,，藥物療效評估,，預后等方面具有重要的臨床應用價值。在肺液體活檢領域,，EGFR突變由于其在東亞人群中的高突變率,實現(xiàn)精細檢測顯得尤為重要,。研究表明，相較于熒光定量PCR,，數(shù)字PCR對于血液ctDNA的檢測靈敏度更高（0.01%）,，EGFR突變的陽性檢出率也更高。在患者術后復發(fā)檢測中,，數(shù)字PCR評估出的ctDNA陽性,，可以早于影像學數(shù)月提前揭示出患者復發(fā)。因此,，該項技術在肺精細診療中具有重要的作用,。深圳雙螺旋生物儀器數(shù)字PCR無創(chuàng)產(chǎn)前篩查有望成為數(shù)字PCR在臨床快速落地的應用。

微滴數(shù)字PCR主要是將兩種互不相溶的液體,，以其中一種作為連續(xù)相（油）,，另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續(xù)中,，從而成液滴,。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優(yōu)勢,。在ddPCR中,，利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數(shù)字PCR的樣品分散載體,。這里,，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液,，然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結(jié)束后檢測每個微滴的熒光信號,。目前Bio-Rad公司的QX100系統(tǒng),、QX200系統(tǒng)均為采用液滴技術的數(shù)字PCR系統(tǒng)。圖6.Bio-Rad的液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)

對于檢測需要高靈敏度以及技術確認的情況下,，數(shù)字PCR技術也可以發(fā)揮重要作用,。技術數(shù)據(jù)表明，數(shù)字PCR技術對的比較低檢測下限可到2copies/ml,，比qPCR靈敏度提升了100倍,。經(jīng)測試,，數(shù)字PCR在檢測和診斷的某些方面優(yōu)于金標準qPCR，尤其是在低病毒載量樣本中,，相比起qPCR,，數(shù)字PCR特異性,、靈敏度,、重現(xiàn)性和檢測限受影響更小。因此,，未來預計數(shù)字PCR技術也將在類疾病中得到更加廣的應用。數(shù)字PCR的應用甚廣,，除了可應用于進行突變的檢測以外,，也可運用于基因擴增的檢測,。通過數(shù)字PCR技術可建立多重熒光體系,，用于同時檢測比如非小細胞肺中常見的MET和HER2耐藥擴增,。有研究報道,，使用數(shù)字PCR技術對436例非小細胞肺樣品進行檢測,，并挑選樣本驗證了數(shù)字PCR與RNA fish的檢測一致性。結(jié)果表明,，該數(shù)字PCR技術在保證了基因擴增檢測準確性的同時,，還節(jié)約了檢測時間,。dPCR可直接溯源SI國際單位制摩爾，適合單一,、雙重及多重轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)研究，一次可識別不同的轉(zhuǎn)基因區(qū)域,。

20世紀末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR,，dPCR)的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份,，分配到不同的反應單元,，每個單元至少包含一個拷貝的目標分子(DNA模板),，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應單元的熒光信號進行統(tǒng)計學分析,。PCR實際上是一個在模板DNA,、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應,，擴增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。數(shù)字PCR是直接數(shù)出DNA分子的個數(shù),，是對起始樣品的定量。上海醫(yī)療系統(tǒng)認證數(shù)字PCR技術

數(shù)字PCR適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域,。臻準數(shù)字PCR試劑盒

ThermoFisherQuantStudio3D是另一個經(jīng)典的芯片式數(shù)字PCR平臺,，其基本的檢測流程是：將反應液加入到涂布器中，通過涂布器將反應液均勻涂布在有20000個微孔的芯片上,，將芯片放在PCR儀上擴增，將芯片放入讀取儀中采取拍照的方式讀取熒光信號,。操作較為復雜，整個過程在封閉的芯片中進行,，污染的風險較低,。STILLANaica是一個較新的數(shù)字PCR平臺，基本的檢測流程是：將反應液加入芯片,，將芯片放入微滴生成擴增系統(tǒng)，生成30,000個微滴單層平鋪于芯片中,，PCR擴增在芯片上完成,。然后將擴增后的芯片轉(zhuǎn)移至微滴閱讀分析系統(tǒng)，采取拍照的方式讀取熒光信號,。由于整個過程在封閉的芯片中進行，污染的風險較低,。臻準數(shù)字PCR試劑盒

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