細胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當個細胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時,，細胞外的鈣離子流入該細胞內(nèi)，促使該細胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級神經(jīng)細胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,，從而構(gòu)成復雜的信號體系，終形成學習,、記憶等大腦的高級功能,。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學活性，而細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響,。細胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細胞。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收。也就是說,，每個時刻,，只有焦平面上一個點的信號被探測。通過點掃描的方式,，一個個點的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點掃描的方式得到圖像。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號。所以只有在光子密度特別大的焦點,，出才會激發(fā)出熒光,。也就是說，雙光子顯微鏡中,，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。美國investigator雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時,，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來,，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點,、觀察！由于電磁波的波長越短,，粒子性越強，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光,，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性。除此之外,，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗,。雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源,；

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達到80至100兆赫,，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求，又能不損傷細胞,，使掃描能更好地進行,。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像。美國雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活,。好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由,。當然壞處也不少，首先是操心，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題。其次是花時間,，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫的，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路,，多花錢,，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長,。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室,，investigator雙光子顯微鏡成像視野是多少