WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡有哪些分類呢,？國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野

配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收,，從而能夠達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。美國(guó)熒光雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或組織的深層觀察,。它的主要特點(diǎn)是使用雙光子激發(fā)來(lái)產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的高分辨率成像,。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性,，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個(gè)過(guò)程需要使用一個(gè)特殊的雙光子激發(fā)源,，它能夠?qū)⒁粋€(gè)光子轉(zhuǎn)換為兩個(gè)光子,，其中一個(gè)光子用于激發(fā)熒光，另一個(gè)光子則用于成像,。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的高分辨率成像，特別是對(duì)于深層組織的觀察,。穿透深度大：雙光子激光的波長(zhǎng)較長(zhǎng),，能夠更好地穿透生物組織，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)深層細(xì)胞的觀察,。熒光壽命長(zhǎng)：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長(zhǎng),，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標(biāo)記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低,，因此對(duì)生物樣品的損傷較小,，可以減少光毒性?？傊?，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù)，可以用于生物學(xué),、醫(yī)學(xué),、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究,。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無(wú)需維護(hù)的激光系統(tǒng),。其輸出波長(zhǎng)為920nm，非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)（如GFP,，eGFP,，Eosin，GCaMP,，CFP,，Calcein或者Venus）的雙光子激發(fā)。能給熒光基團(tuán)提供比較高的峰值功率,，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光有關(guān)的生物光子學(xué)學(xué)科,。而且其獨(dú)特設(shè)計(jì)（制造簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的光源）對(duì)雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中,，峰值功率就是亮度,！如果您希望獲得比較好的圖像亮度，那么你就需要短脈沖,，高功率,，較重要的是需要干凈的時(shí)間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率，較短的脈沖和獨(dú)特的Clean-Pulse技術(shù),，以及具有相對(duì)比較高的峰值功率,，使得其在雙光子顯微鏡中可以實(shí)現(xiàn)****的亮度，而不會(huì)對(duì)樣品造成不必要的加熱,。FemtoFiberultra920交鑰匙,，完全集成的色散補(bǔ)償（可確保樣品處的脈沖較短），內(nèi)置的功率控制,，操作直觀以及其堅(jiān)固而緊湊的設(shè)計(jì),，使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗(yàn)，是非線性顯微鏡應(yīng)用的較好解決方案,。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對(duì)比機(jī)制,。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。

其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或意義不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的。一般來(lái)說(shuō),，觀察時(shí),，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來(lái),。如果兩個(gè)相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大很大程度，也可能看到兩個(gè)相交的亮點(diǎn)(艾里斑),，沒(méi)有明顯的邊界(更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了),，說(shuō)明分辨率不夠。沒(méi)有分辨率談放大是沒(méi)有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，大約是光波波長(zhǎng)的一半。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限,，但準(zhǔn)確的說(shuō)應(yīng)該叫分辨率極限,。原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種,，被攝體像REM,。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM),。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像,，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間，即可得到真實(shí)的晶體表面像,。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度、細(xì)胞運(yùn)動(dòng),、進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè),。國(guó)內(nèi)熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對(duì)樣品進(jìn)行三維觀察,。國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野

WinfriedDenk使用的第1個(gè)光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs,，可見光波長(zhǎng)630nm)。染料激光雖然實(shí)驗(yàn)室演示可以接受,，但是使用起來(lái)不方便,，所以離商業(yè)化還很遠(yuǎn)。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)光源變成了飛秒鈦寶石激光器,。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點(diǎn)外,，還具有近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍寬，而近紅外比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品的損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)左側(cè),。從雙光子到三光子科學(xué)家們正在從雙光子顯微鏡轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk的導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博時(shí)發(fā)明了三光子顯微鏡,。如果雙光子吸收是可行的,，那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約1.3和1.7微米,，成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米,，人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比,，三光子需要使用更強(qiáng),、更短、重復(fù)率更低的激光脈沖,，這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿足的,，但對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易,。國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野