對生物樣品的三維觀測是了解細(xì)胞功能的重要方法之一,。目前已有的三維熒光成像技術(shù)包括光片顯微成像技術(shù)、晶格光照明技術(shù)以及激光掃描顯微成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡）等,。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉(zhuǎn)盤可以進行多焦點的激光掃描,，提高時間分辨率,，而且有利于減少活細(xì)胞成像中的光損傷。本篇文獻主要實現(xiàn)了可見光雙光子激發(fā)及多焦點激光掃描的結(jié)合,，終提高了3D延時掃描中的空間分辨率及成像對比度,，同時這也是可見光雙光子激發(fā)（v2PE）在超高分辨率顯微鏡中的應(yīng)用,。雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究,。雙光子顯微鏡多少錢

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。激光雙光子顯微鏡授權(quán)商雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進行長時間在體成像,。

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing）,，增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積，并同時保持較高的時間和空間分辨率,。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針,，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩個不同顏色，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針,，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄,。為了實現(xiàn)三維空間成像，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng),，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）,。由此，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面,，覆蓋縱深達600微米,，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達到2000個以上,。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達檢測器。若要提高信號強度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測效率,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本“透明度”提高。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰。美國investigator雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當(dāng)中。雙光子顯微鏡多少錢

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測***時先聚焦,，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進行掃描，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。雙光子顯微鏡多少錢