激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上,，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測(cè)***時(shí)先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理,。這個(gè)裝置能讓通過探測(cè)***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時(shí)通過改變物鏡的焦距,，能對(duì)不同焦平面進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測(cè)的三維圖像,。雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商

在2020年12月22日,，臨研所,、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位,，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào),，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”，并被Nature Methods評(píng)為2018年度“年度方法--無限制行為動(dòng)物成像”,。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時(shí)病理,、離體組織檢測(cè),、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。ultimainvestigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線為光源,，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長(zhǎng)更短的紫外線,，再將可見光過濾掉,，提高了分辨力率,。而當(dāng)被檢物體過厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上,，使觀察到的像模糊,、發(fā)虛，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu),。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上,，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問題,。雙光子顯微鏡不需要共聚焦,，提高了熒光檢測(cè)效率。

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬,、630 nm可見光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊,。科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，Chris Xu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡品牌有哪些,？國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式

在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比,，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521 nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU,，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡供應(yīng)商