使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，適用于長時間的研究,。美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡的成像視野

其實電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義,，準(zhǔn)確的來說，不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的。通俗的來說,，就是進(jìn)行觀察的時候,，除了要將物體放大，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來,。如果兩個相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大到很大，看到的可能卻是兩個相交的亮斑（艾里斑）,，而沒有明顯的界限（更不用說細(xì)節(jié)了）,，這表示是分辨率不夠。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，約等于光波波長的一半，通常被說成是光學(xué)顯微鏡放大極限,，其實準(zhǔn)確地來說,，應(yīng)該叫做分辨率的極限。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實驗證明了電子的波動性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種,，題主說的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）,。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點而生成倒易空間里的衍射圖像，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實空間,，得到真正的晶體表面圖像了,。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡廠家有哪些雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。

配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點掃描的效果。

WinfriedDenk使用的第1個光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs,，可見光波長630nm),。染料激光雖然實驗室演示可以接受，但是使用起來不方便,，所以離商業(yè)化還很遠(yuǎn),。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點外,，還具有近紅外波長調(diào)諧范圍寬,，而近紅外比可見光穿透更深,，對生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺左側(cè),。從雙光子到三光子科學(xué)家們正在從雙光子顯微鏡轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk的導(dǎo)師實驗室)讀博時發(fā)明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的,，那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米,，成像深度比雙光子更深,。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米,。與雙光子顯微鏡相比,，三光子需要使用更強(qiáng)、更短,、重復(fù)率更低的激光脈沖,，這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易,。雙光子顯微鏡供應(yīng)商找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司。

生物樣品的三維觀察是了解細(xì)胞功能的重要方法之一,。目前已有的三維熒光成像技術(shù)有光學(xué)顯微鏡,、點陣照明和激光掃描顯微鏡(如共焦顯微鏡和雙光子顯微鏡)。其中,，激光掃描顯微鏡利用轉(zhuǎn)盤可以進(jìn)行多焦點激光掃描,，提高了時間分辨率，有利于減少活細(xì)胞成像中的光損傷,。本文主要實現(xiàn)可見光雙光子激發(fā)和多焦點激光掃描的結(jié)合,，**終提高三維延遲掃描中的空間分辨率和成像對比度，這也是可見光雙光子激發(fā)(v2PE)在超高分辨率顯微鏡中的應(yīng)用,。雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?國外ultima雙光子顯微鏡光子探測

雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達(dá)到熒光激發(fā)能量閾值,，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號。美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡的成像視野

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作和免維護(hù)的激光系統(tǒng)其輸出波長為920nm,，非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)(如GFP,、eGFP、曙紅,、GCaMP,、CFP,、鈣黃綠素或金星)的雙光子激發(fā)。它可以為熒光基團(tuán)提供相對較高的峰值功率,，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光相關(guān)的光子學(xué),。此外，其獨特的設(shè)計(簡單和經(jīng)濟(jì)的光源)具有創(chuàng)新雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的潛力,。在雙光子顯微鏡中,，峰值功率就是亮度！如果你想獲得更好的圖像亮度,，那么你需要短脈沖,，高功率，更重要的是,，干凈的時間脈沖形狀,。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率、短脈沖,、獨特的Clean-Pulse技術(shù)和相對較高的峰值功率,，這使得在雙光子顯微鏡中實現(xiàn)****亮度而無需對樣品進(jìn)行不必要的加熱成為可能。FemtoFiberultra920全包式,、完全集成的色散補(bǔ)償(可確保樣品處的短脈沖),、內(nèi)置電源控制、直觀的操作及其堅固緊湊的設(shè)計使系統(tǒng)具有非常友好的用戶體驗,，是非線性顯微鏡應(yīng)用的良好解決方案,。例如，熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機(jī)制美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡的成像視野