雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。國外激光熒光雙光子顯微鏡商家

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復雜機制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動,；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要較提高2PM的成像速率,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點,，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像，虛擬源越遠,，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm。進口ultima雙光子顯微鏡成像原理雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進行成像,。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導樹突鈣離子動態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯,。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場達到5毫米,，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像。根據(jù)清華大學單一采購來源的**指導意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來,，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量，發(fā)展速度可見一斑,。

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP,，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學獎,，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。光學成像本身具有高分辨率,、高通量、非侵入和非毒性等特點,，再與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合,，使得科學家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的,，生物學家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前,，大多數(shù)細胞生物學和生理學研究主要還是在離體培養(yǎng)的細胞體系中研究,。然而與細胞生物學研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律,。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收,，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy,，簡稱TPM）的發(fā)明,，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學特性,，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點,，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學家進行神經(jīng)成像較理想的工具,。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具,。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間,。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強,。類似的，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方,。類似的，早晨的太陽非常紅,，也就是因為長波長的紅光穿透力更強,。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。在深度組織中以較長時間對細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選,。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。國外激光熒光雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了,。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護也更加自由,。當然壞處也不少，首先是操心,，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案，后來要解決各種實際問題,。其次是花時間,，加上買配件的時間，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol，大多是老外寫的,，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室國外激光熒光雙光子顯微鏡商家