1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強(qiáng)。類似的,，平時(shí)用手電筒照射手指,，會(huì)看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少,。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長λ的四次方。類似的,，早晨的太陽非常紅,，也就是因?yàn)殚L波長的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強(qiáng),。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比,，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長波長光束散射程度低(RayleighScattering),，所以穿透能力強(qiáng),。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺(tái),，只需分光即可,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。熒光激光雙光子顯微鏡成像技術(shù)微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。

雙光子之源：飛秒激光雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強(qiáng)度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,。基于以上分析,，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動(dòng)動(dòng)物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式，可用于在動(dòng)物覓食,、哺乳,、跳臺(tái),、打斗、嬉戲,、睡眠等自然行為條件下,，或者在學(xué)習(xí)前、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后,，長時(shí)程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動(dòng)態(tài)變化。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會(huì),、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會(huì)議上報(bào)告后,，得到包括多位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽(yù)。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會(huì)議,、美國明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評(píng)述中寫道,，“從任何一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來看，這款顯微鏡都了一項(xiàng)重大技術(shù)發(fā)明,，必將改變我們在自由活動(dòng)動(dòng)物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,。它所開啟的大門，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像,。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代,，即通過對細(xì)胞群體中可辨識(shí)的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進(jìn)行成像觀測，從而更加深刻地理解進(jìn)化所造就的大腦環(huán)路實(shí)現(xiàn)復(fù)雜行為的重要工程學(xué)原理,。毫無疑問,，這項(xiàng)非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標(biāo)邁進(jìn)了一步?！彪p光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例,；

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡非常適合對細(xì)胞組織進(jìn)行長時(shí)間在體成像,。熒光激光雙光子顯微鏡應(yīng)用

雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物,。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

為了驗(yàn)證動(dòng)物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力，本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1,，見圖3(a),(c)-(i)。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,，對比可見v2PE在空間分辨率,、激發(fā)深度級(jí)圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高。此外,，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長的熒光蛋白,，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動(dòng)力學(xué)多色成像。在此基礎(chǔ)上,，實(shí)驗(yàn)對海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像,，見圖3(j)-(n)，青色為mTFP1,綠色為EGFP,，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像,，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號(hào)分離出來。國外2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少