微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的方式,，可用于在動物覓食,、哺乳、跳臺,、打斗,、嬉戲、睡眠等自然行為條件下,，或者在學習前,、學習中和學習后，長時程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元,、神經(jīng)網(wǎng)絡、遠程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動態(tài)變化,。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后,，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學家的高度贊譽,。冷泉港亞洲腦科學專題會議、美國明顯神經(jīng)科學家加州大學洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道,，“從任何一個標準來看,，這款顯微鏡都了一項重大技術發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的方式,。它所開啟的大門,，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像,。系統(tǒng)神經(jīng)生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的復雜生物學事件進行成像觀測,，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環(huán)路實現(xiàn)復雜行為的重要工程學原理,。毫無疑問，這項非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標邁進了一步,?！彪p光子顯微鏡角膜成像。國外investigator雙光子顯微鏡熒光探測

在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面,，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時,，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強度,，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況,，并進行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量,。對另一半子區(qū)域重復這一測量過程,，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短,，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品,。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物,、醫(yī)學問題提供了可行性方案,。熒光激光雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源；

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術的空間分辨率，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。

1990年初,，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質(zhì)的相互作用,。當時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重煥新生,；

相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學顯微鏡做不到的事情嗎？原來,，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標本進行定點,、***觀察！由于電磁波的波長越短,，粒子性越強,，受散射影響也就越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光,，在增加了激光的穿透性的同時還減少了對細胞的毒性,。除此之外，因為只有物鏡焦點處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應,，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點之外的熒光物質(zhì)消耗,。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學效應,。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡聯(lián)系方式

雙光子顯微鏡的原理是什么,？國外investigator雙光子顯微鏡熒光探測

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬、630 nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊,?？茖W家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，Chris Xu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。國外investigator雙光子顯微鏡熒光探測