在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號強度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實驗,；進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光損傷

1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強。類似的,，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方。類似的,，早晨的太陽非常紅,，也就是因為長波長的紅光穿透力更強。這兩點共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強,。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比,，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長波長光束散射程度低(RayleighScattering),，所以穿透能力強,。美國ultima雙光子顯微鏡作用優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對***細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16,，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究,；

FHIRM-TPM 2.0擴大了微型雙光子顯微鏡的適用性和實用性，使神經(jīng)科學(xué)家能夠更自由地探索更多新的行為范式,，包括身體運動,、長時程的復(fù)雜過程，如學(xué)習(xí)和記憶，社會互動和恐懼條件反射,，甚至是慢性疾病的進(jìn)展和老化,，如神經(jīng)發(fā)生和再生，疾病進(jìn)展和衰老,，以破譯大腦的奧秘,。在一批“早鳥項目”中，該系統(tǒng)已被多個研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式,，如小鼠的社交新穎性識別,、斑胸草雀受***調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項研究,。依托兩代微型化雙光子成像技術(shù),，該團(tuán)隊還在南京市江北新區(qū)建立了規(guī)模化高通量腦功能成像的南京腦觀象臺（Nanjing Brian Observatory）,，于2020年12月10日舉辦了落成典禮,。通過與世界范圍內(nèi)的神經(jīng)科學(xué)家進(jìn)行廣合作，腦觀象臺現(xiàn)正在服務(wù)三十多個科研項目,，成為開展大型腦科學(xué)問題研究的重要科研服務(wù)平臺,。雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像,。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點掃描的效果,。成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備,。國外bruker雙光子顯微鏡的成像視野

雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光損傷

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時,，在波長為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡光損傷