1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強。類似的,，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少,。2.生物組織對紅外光的散射弱。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方,。類似的,，早晨的太陽非常紅，也就是因為長波長的紅光穿透力更強,。這兩點共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強,。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長的激光去激發(fā)熒光團(tuán),。長波長光束散射程度低(RayleighScattering),，所以穿透能力強,。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,，只需分光即可,。ultimainvestigator雙光子顯微鏡應(yīng)用

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明,，在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司,；

目前,，世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼，中國的腦計劃也即將啟動,。其中,，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點研究方向，而如何打破尺度壁壘,，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日,，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭,，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊,，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章,。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄,。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高,，擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動態(tài)成像等。然而,，***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號強度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子過期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實驗室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了,。其次是靈活，可以選擇針對特殊用途的搭配,，改動也靈活,。好處就是可以鍛煉隊伍，一趟走下來可以把新手帶出來,，后期維護(hù)也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心,，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案，后來要解決各種實際問題,。其次是花時間，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol，大多是老外寫的,，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒有經(jīng)驗的時候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享，希望能幫到想自己動手的實驗室,，雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡,。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡用途

雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用；ultimainvestigator雙光子顯微鏡應(yīng)用

Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).ultimainvestigator雙光子顯微鏡應(yīng)用