對于雙光子（2P）鈣成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)*da的深度限制因素,，而對于三光子成像這兩個(gè)問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào),。功能性三光子顯微鏡比結(jié)構(gòu)性三光子顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描,，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng),；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào),。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來,，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布guangfan的神經(jīng)元的活動(dòng),，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué),，就需要MPM具備對神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力,。快速M(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)近年來出現(xiàn)了通過植入性的顯微鏡或透鏡進(jìn)行活動(dòng)動(dòng)物鈣成像的技術(shù),。美國在體鈣成像動(dòng)物行為學(xué)

傳統(tǒng)的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠?qū)Υ竽X淺層的神經(jīng)元或在離體組織上進(jìn)行成像,，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大,，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術(shù)的迅速發(fā)展,，在體鈣成像技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展,。雙光子熒光顯微鏡能夠在進(jìn)行在體成像的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)高分辨率和高信噪比。例如,，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號(hào)進(jìn)行成像,，研究神經(jīng)元突觸后長時(shí)程降低(Wangetal.,2000)；觀察在體小鼠運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)元在嗅覺選擇任務(wù)中刺激相關(guān)電位(Komiyamaetal.,2010)等等。不過,，這些實(shí)驗(yàn)還是需要對動(dòng)物進(jìn)行麻醉和固定,，而神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域很多研究更希望能夠?qū)ψ杂苫顒?dòng)的動(dòng)物進(jìn)行研究。近年來出現(xiàn)了通過植入性的microscope或microlens進(jìn)行在體freelymoving動(dòng)物鈣成像的技術(shù),。使用一端帶有GRINlens的光纖連接顯微鏡和動(dòng)物大腦,，從特定腦區(qū)發(fā)出的熒光信號(hào)被光纖收集，然后通過Inscopix顯微鏡成像,。動(dòng)物頭部只需植入GRINlens,，方便活動(dòng)。重慶inscopix鈣成像哪里有鈣成像系統(tǒng)支持聯(lián)網(wǎng),，基于網(wǎng)絡(luò)的軟件可讓您隨時(shí)隨地監(jiān)控?cái)?shù)據(jù),。

神經(jīng)元鈣成像技術(shù)離不開鈣離子指示劑的應(yīng)用，不同類型的指示劑各有其獨(dú)特的功能,。那么這些指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞的呢,？目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究,。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中,。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元,，觀察對象為一群神經(jīng)元,。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比,，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng),。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑,。

單光子顯微技術(shù)是*成熟的熒光顯微技術(shù),，但由于單光子顯微技術(shù)使用的激發(fā)光波長較短，成像深度比較有限,；能量比較大,會(huì)造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重,。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實(shí)現(xiàn)樣本三維成像要逐點(diǎn)掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時(shí)間活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。而寬場顯微鏡能夠很好地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實(shí)時(shí)檢測,，但寬場顯微鏡由于離焦信號(hào)的干擾,難以實(shí)現(xiàn)多維成像,。細(xì)胞對鈣離子有一套完備的監(jiān)控系統(tǒng)以維持鈣的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。

鈣是機(jī)體的組成元素之一,。鈣離子作為電流載體維持細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度,，同時(shí)在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著重要角色。作為第二信使,，鈣參與細(xì)胞周期,、細(xì)胞代謝、細(xì)胞分化、壞死,、凋亡等等許多重要的生理過程,。細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平通常很低，一般胞漿中的自由鈣約為100nM,。胞內(nèi)的鈣可被各種亞細(xì)胞器所貯存,，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道：其中約50%位于細(xì)胞核，30%位于線粒體,，14%位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),，5%位于胞膜上，1%位于胞質(zhì)內(nèi),，且因?yàn)殁}離子易與磷酸和碳酸復(fù)合物形成不溶物,，故游離鈣只占[1]。細(xì)胞可以通過鈣內(nèi)流,、內(nèi)鈣釋放及膜系統(tǒng)上的降鈣蛋白等一整套完整的監(jiān)控系統(tǒng)來維持細(xì)胞內(nèi)鈣的內(nèi)穩(wěn)狀態(tài),。例如與鈣內(nèi)流相關(guān)的通道例如電壓門控性鈣離子通道VDCC、受體活躍的通道RACC,；與內(nèi)鈣釋放相關(guān)的受體如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體,；以及降鈣相關(guān)的脂膜及線粒體上的主動(dòng)運(yùn)輸?shù)拟}泵系統(tǒng)等等[2]。近20年來鈣的熒光成像及測定技術(shù)發(fā)展迅速,，出現(xiàn)了各種各樣的鈣熒光指示劑,，結(jié)合不斷發(fā)展的顯微成像系統(tǒng)，我們可以對活細(xì)胞的鈣離子進(jìn)行測定及成像,，進(jìn)一步揭示其生理機(jī)制及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制,。鈣成像的熒光指示劑鈣成像的熒光探針一般均為Ca2螯合劑EGTA，APTRA,，BAPTA的衍生物,，它們可以結(jié)合鈣離子從而顯示一個(gè)光譜響應(yīng)。雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展,，使在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于活動(dòng)狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進(jìn)展,。浙江在體鈣成像grain lens

鈣離子成像可以用于感知覺，學(xué)習(xí)記憶,，社會(huì)性行為等各種各樣的研究中,。美國在體鈣成像動(dòng)物行為學(xué)

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號(hào)分子其作用具有時(shí)間性和空間性。當(dāng)個(gè)細(xì)胞興奮時(shí),，產(chǎn)生了一個(gè)電沖動(dòng)，此時(shí),，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合，促使這一級(jí)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動(dòng),。以此類推,，神經(jīng)信號(hào)便一級(jí)一級(jí)地傳遞下去，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號(hào)體系,，較終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級(jí)功能。在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中,，鈣離子同樣扮演著重要的信號(hào)分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM，而細(xì)胞興奮時(shí)鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍,，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時(shí)也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時(shí)受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時(shí)觀察多個(gè)功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。美國在體鈣成像動(dòng)物行為學(xué)

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