雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動(dòng)態(tài)成像,，雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、遺傳發(fā)育,、藥物代謝等領(lǐng)域,。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度,、細(xì)胞運(yùn)動(dòng),、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè)，而且能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。同時(shí)，雙光子顯微鏡能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)**在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,，并可對(duì)**治療過程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估,。隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù),、計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微技術(shù)會(huì)得到更大提升和更廣的應(yīng)用，未來(lái)不僅用于基礎(chǔ)研究,，也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用,。雙光子顯微鏡型號(hào)有哪些？國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡聯(lián)系方式

許多生物醫(yī)學(xué)成像方式,，無(wú)論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子),，都使用激光作為光源，并需要兼容的熒光染料,。熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng),，它們可以被單個(gè)光子以該激發(fā)波長(zhǎng)的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個(gè)幾乎同時(shí)到達(dá)的光子，但每個(gè)光子的能量約為單光子能量的一半,，即雙波長(zhǎng)(0.5E->2λ),。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理,。在對(duì)同一種熒光染料進(jìn)行成像時(shí),，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長(zhǎng)，因此雙光子的散射較小(波長(zhǎng)較長(zhǎng),，散射較小),，可以更深入地滲透到組織中,。雙光子顯微鏡ultima2PPLUS在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來(lái),，不斷發(fā)展，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門,。同時(shí)，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,。科學(xué)進(jìn)入21世紀(jì),，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織,，需要能夠更真實(shí)地探索生命，在體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化,。此時(shí),，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350 nm光的激發(fā)下發(fā)出450 nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí),，可采用700 nm的激發(fā)光得到450 nm熒光。

美國(guó)霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小組與來(lái)自中科院上海光機(jī)所強(qiáng)場(chǎng)激光物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王琛博士較近成功將一種新的自適應(yīng)光學(xué)的方法和雙光子顯微鏡結(jié)合,，研制出一種新的自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡,。通過校正小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數(shù)倍的成像分辨率和信號(hào)強(qiáng)度,，明顯改進(jìn)了成像質(zhì)量,，使得原來(lái)在鼠腦中不可見或者模糊的細(xì)節(jié)變得清晰可見，她們成功將該方法應(yīng)用于老鼠視覺皮層第五層（約500μm）的形貌結(jié)構(gòu)成像和鈣離子功能成像,。這一新的自適應(yīng)光學(xué)方法,，使得在小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現(xiàn)實(shí)。這一成果發(fā)表在較新一期的《Nature Methods》,。雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究,；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦）,，這樣就提高了對(duì)熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高,；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16，明顯降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究；如果已經(jīng)有了飛秒光,，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺(tái),，只需分光即可。美國(guó)熒光激光雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)

雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡聯(lián)系方式

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡聯(lián)系方式

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