在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下,，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動態(tài)成像中心,、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團隊，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像,。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊Nature Methods (IF 25.3),，相關(guān)技術(shù)文檔同步發(fā)表于Protocol Exchange (DOI: 10.1038/protex.2017.048)，并已申請多項,。雙光子顯微鏡知多少。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的，任何事物都有優(yōu)缺點,，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進拍攝；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。進口ultimainvestigator雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面,，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域,，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制。同時,，她們用數(shù)字微陣列光處理器,，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉,，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息,，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程,，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正,。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復(fù)雜的計算,，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品,。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量,。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物,、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案。

激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡,，通過探測***時先聚焦,，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理,。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確，同時通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進行掃描,，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像。雙光子顯微鏡能夠進行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。

高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進行,。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點,，避免了層與層之間的互相干擾，極大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。國外激光熒光雙光子顯微鏡掃描深度

成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

實驗從理論和實驗上評估了多焦點v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進行了對比,，實驗中v2PE的激發(fā)波長為521 nm，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU,，對直徑100nm的熒光顆粒進行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177 nm和297 nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點擴散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

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