對生物樣品的三維觀測是了解細胞功能的重要方法之一。目前已有的三維熒光成像技術包括光片顯微成像技術,、晶格光照明技術以及激光掃描顯微成像技術（如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡）等,。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉盤可以進行多焦點的激光掃描，提高時間分辨率,，而且有利于減少活細胞成像中的光損傷。本篇文獻主要實現了可見光雙光子激發(fā)及多焦點激光掃描的結合,，終提高了3D延時掃描中的空間分辨率及成像對比度,，同時這也是可見光雙光子激發(fā)（v2PE）在超高分辨率顯微鏡中的應用。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰。進口2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

光學顯微鏡和電子顯微鏡本質的區(qū)別在于，光學顯微鏡：用的是可見光電子顯微鏡：用的是高頻電子射波有什么區(qū)別,，在于一個基本的原理,，光的衍射。,。,。光波是一個有趣的東西，其中有一項,，如果物體的體積小于光的波長,，光一般可以繞過去，不發(fā)生明顯變化,。也就是說,，有這個物體和沒這個物體，在這種情況下,，光是不會發(fā)生明顯改變的,。可見光的波長（肉眼）：380～780納米,，也就是,，如果比380納米還要小的東西，用光學顯微鏡,，無論你放大多少倍,，也是看不見的。因為光繞過去了,。,。。光的衍射為了克服這個問題,，科學家用波長更短的光去照射物體,，也是就被觀測物。比如10納米級的光,，這樣,，就能看到我們用肉眼無論如何都看不見的東西。這就是電子顯微鏡多說一句,，光速是不變的,。光速=頻率×波長。波長越短,，頻率越大,。。頻率越大,，光波的能量越大,。這就是為什么電子顯微鏡的功率越大,，能看到的東西越小。顏色取決于物體能反射光的波長的長短當你看到的物體小于較小可見光的波長,，那它就是沒有顏色的,。。,。因為顏色是肉眼對于可見光頻率在大腦中的投影,。。,。,。所以只能把他們統(tǒng)一變?yōu)楹诎住?。,。沒有顏色不是透明的意思，它們不是肉眼可見顏色的定義中包含的,。美國investigator雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例,；

雙光子技術在醫(yī)療診斷應用中具有巨大的潛力，該領域還未形成標準和體系,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學研究與龐大的醫(yī)療數據加以支撐,，通過研究人體基于多光子成像技術，進行細胞結構,、生化成分,、微環(huán)境、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息,，找到與疾病的細胞學、分子生物學,、組織病理學,、診斷和特征的關聯關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制,，篩選鑒定,、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據,，建立全新的多光子細胞診斷的完整數據庫,，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產品標準。討論環(huán)節(jié),，來自病理科,、呼吸中心、心臟科,、神經科,、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結合各自的工作領域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學術交流,。通過本次學術交流,，病理科與研究所分別與王愛民副教授課題組達成了初步合作意向。

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術,。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短激發(fā)態(tài)后,，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。因其光損傷小、樣本透射深等優(yōu)勢,，使得觀察熒光細胞成為可能,。中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的***成像研究。以小鼠顱內***成像為優(yōu)勢,，可動態(tài)**觀察小鼠顱內神經細胞,、小膠質細胞/巨噬細胞、周細胞,、血管,、轉移瘤細胞、膠質瘤細胞等的變化情況,，在**學,、神經生物學、發(fā)育生物學,、神經退行性疾病等領域具有廣泛應用,。小鼠其它組織臟器，如脾,、肺,、顱骨、股骨,、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡在各領域研究中已有許多成功實例,。國內激光雙光子顯微鏡光子探測

雙光子顯微鏡不需要共聚焦細孔，提高了熒光檢測效率,。進口2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，明顯降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質進行成像研究；進口2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

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