有許多方法可以實現(xiàn)快速光柵掃描,，例如使用振鏡進行快速2D掃描,，以及將振鏡與可調(diào)電動透鏡相結(jié)合進行快速3D掃描,。而可調(diào)電動式鏡頭由于機械慣性的限制,，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代,。遠程對焦也是實現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示,。LSU模塊中，掃描振鏡水平掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)整M的位置實現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學像差，還可以進行快速軸向掃描,。為了獲得更多的神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設計來放大FOV。然而,，大NA和大FOV的物鏡通常很重,，不能快速移動以進行快速軸向掃描，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡,。多光子顯微鏡市場集中，由于投產(chǎn)生產(chǎn)的成本較高,，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。熒光多光子顯微鏡技術(shù)

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細胞的生理反應具有重要的作用,，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進行觀測,，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細胞內(nèi)用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。激光掃描多光子顯微鏡系統(tǒng)多光子顯微鏡的大多數(shù)補償器都采用棱鏡,。

Ca2+是重要的第二信使,，對于調(diào)節(jié)細胞的生理反應具有極其重要的作用，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進行觀測,，可以從某些方面對有機體或細胞的變化機制進行分析,，具有重要的意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細胞內(nèi)用熒光探針標記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化,。通過對單細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+不僅在細胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差,。

作為一個多學科、知識密集型和資金密集型的高科技產(chǎn)業(yè),，多光子顯微鏡涉及醫(yī)學,、生物學、化學,、物理學,、電子學、工程學等多個學科,。其生產(chǎn)工藝相對復雜,，進入門檻較高。它是衡量一個國家制造業(yè)和高科技發(fā)展水平的重要標準之一,。在過去的五年里,，多光子顯微鏡的市場是集中的。由于投產(chǎn)成本高,，技術(shù)難度大,，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)并不多。顯微鏡作為傳統(tǒng)的高科技產(chǎn)業(yè),，并沒有被其他技術(shù)顛覆,，而是一直在不斷融合發(fā)展相關(guān)技術(shù)，在醫(yī)療等精密檢測領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。顯微鏡的商業(yè)化發(fā)展已進入成熟階段,，主要需求來自教學,、生命科學研究和精密測試等。全球市場呈現(xiàn)溫和增長趨勢,。而顯微鏡產(chǎn)品(如多光子顯微鏡,、電子顯微鏡)正在刺激市場需求，多光子顯微鏡市場發(fā)展?jié)摿薮?。多光子顯微鏡在基礎科學和臨床診斷領(lǐng)域的應用范圍正在持續(xù)增長,。

根據(jù)阿貝成像原理，許多光學成像系統(tǒng)是一個低通濾波器,，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會限制高頻信息通過，只允許一定的低頻通過,，因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細節(jié)變模糊,，降低分辨率。對于三維成像來說,，寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息,，同時還包含焦平面外的樣品信息。由于受到焦平面外的信息干擾,，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像,。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率、獲得層析圖像,，是因為利用特定結(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息,，當結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制,，超出這一區(qū)域,，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰鳎簿褪侵挥薪姑娓浇挠邢迏^(qū)域具有相對完整的頻譜信息,，離焦后，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像,。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結(jié)構(gòu),。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率,。美國靈長類多光子顯微鏡三維分辨率

多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學家普遍的運用于實驗中。熒光多光子顯微鏡技術(shù)

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度。近年來,，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描,。但遠程對焦時對反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球差和高階像差,，無法進行高分辨率成像,。為了克服這些限制，該小組引入了一種新的光學設計,，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無球面像差的軸向掃描,，以實現(xiàn)高分辨率成像。有兩種方法可以實現(xiàn)這種設計,。***個可以執(zhí)行離散的軸向掃描,，另一個可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描。如圖3a所示,，特定裝置由兩個垂直臂組成,，每個臂具有4F望遠鏡和物鏡。遠程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成,，另一個臂(稱為照明臂)由浸沒物鏡(OBJ2)組成,。兩個臂對齊，使得GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛,。準直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進入遠程聚焦臂,，由GSM進行掃描，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點可以進行水平掃描,。熒光多光子顯微鏡技術(shù)

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