從雙光子的原理和特點(diǎn)，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見(jiàn)光或近紅外光作為激發(fā)光源,，因此該波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合長(zhǎng)期研究；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比,，可見(jiàn)光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng),，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問(wèn)題,；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)處體積約為波長(zhǎng)三次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，焦點(diǎn)外的區(qū)域不會(huì)發(fā)生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比,，雙光子成像不需要濾光片(共焦),，提高了熒光收集率，直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高,；☆圖像對(duì)比度高:由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16，減少了散射的干擾,；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā),，因此可以用來(lái)對(duì)生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像；雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像原理

    其實(shí)電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或者存在的比較大意義,，準(zhǔn)確的來(lái)說(shuō)，不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的,。通俗的來(lái)說(shuō)，就是進(jìn)行觀察的時(shí)候,，除了要將物體放大,，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開(kāi)來(lái)。如果兩個(gè)相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大到很大,，看到的可能卻是兩個(gè)相交的亮斑（艾里斑），而沒(méi)有明顯的界限（更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了）,，這表示是分辨率不夠,。拋開(kāi)分辨率談放大倍數(shù)是沒(méi)有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，約等于光波波長(zhǎng)的一半,，通常被說(shuō)成是光學(xué)顯微鏡放大極限，其實(shí)準(zhǔn)確地來(lái)說(shuō),，應(yīng)該叫做分辨率的極限,。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能。電子顯微鏡也有多種,，題主說(shuō)的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）,。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點(diǎn)而生成倒易空間里的衍射圖像，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實(shí)空間,，得到真正的晶體表面圖像了,。 國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡價(jià)位雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。

摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點(diǎn)（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm的紅光發(fā)射特性,。在638nm激光照射下，除了長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射外,，還可以實(shí)現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生,，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了巨大的可能性。更重要的是,，通過(guò)各種表征和理論模擬證實(shí),，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用,。這種親和力不僅為實(shí)現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能，而且通過(guò)ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，賦予治療過(guò)程中的熒光變異,。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力、光動(dòng)力療法（PDT）過(guò)程中的熒光變化,、長(zhǎng)波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)處理的智能CDs,。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子**過(guò)期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此,，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配,，改動(dòng)也靈活。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái),，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心,，特別是第1次搭的時(shí)候，開(kāi)始要想方案,，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題,。其次是花時(shí)間，加上買配件的時(shí)間,，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol,，大多是老外寫的,，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時(shí)間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買,，在國(guó)內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),，貼出來(lái)分享，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室雙光子顯微鏡的應(yīng)用中,，該如何選擇以及更好的使用PMT,。

雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像，從而測(cè)量不透明腦深部的活動(dòng),。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng),，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快了。目前,，電壓成像主要由寬視場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像,。因此,，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后,，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器,。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,。虛光源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小,。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；雙光子顯微鏡光子探測(cè)

雙光子顯微鏡除了可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝以外呢,，可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行成像。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像原理

雙光子技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力,。這方面沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)和體系,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究和龐大的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐,。通過(guò)基于多光子成像技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分,、微環(huán)境,、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,，可以發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞學(xué),、分子生物學(xué)、組織病理學(xué),、疾病的診斷和特征的關(guān)系,。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選皮膚病,、自身免疫性疾病等疑難疾病的識(shí)別,、診斷和鑒別診斷依據(jù),，建立全新完整的多光子細(xì)胞診斷數(shù)據(jù)庫(kù),，明確不同疾病的多光子臨床檢測(cè)設(shè)備產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。在討論環(huán)節(jié),，來(lái)自病理科,、呼吸中心、心內(nèi)科,、神經(jīng)內(nèi)科,、皮膚科、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域,，與王愛(ài)民副教授進(jìn)行了熱烈的討論,。其中，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請(qǐng)王愛(ài)民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流,。通過(guò)此次學(xué)術(shù)交流,，病理學(xué)系和研究所分別與王愛(ài)民副教授課題組達(dá)成了初步合作意向。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像原理