當(dāng)激光光束焦點(diǎn)的位置在鏡面上,，此時被反射的激光在無限空間中成為準(zhǔn)直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑,。同理,，如果橫向掃描光束，則會形成遠(yuǎn)離傾斜鏡鏡面的焦點(diǎn),，這又導(dǎo)致返回的光束會聚或發(fā)散,，進(jìn)而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點(diǎn)，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描,。對于較小的傾斜角,，聚焦沒有球差。該組在實(shí)驗(yàn)中表征了這種將橫向掃描轉(zhuǎn)換為軸向掃描技術(shù)的光學(xué)性能,，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數(shù)量級,，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學(xué)。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12 kHz進(jìn)行共振遠(yuǎn)程聚焦,，該技術(shù)可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學(xué)進(jìn)行快速成像，并具有衍射極限的分辨率,。利用多光子顯微鏡的光遺傳學(xué)操作能力,，我們可以對某類神經(jīng)元的ji活和失活進(jìn)行高精度的操作。bruker多光子顯微鏡原理

多束掃描技術(shù)可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像,。該技術(shù):對于兩個遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上),，通常采用兩個**的路徑進(jìn)行成像；對于相鄰區(qū)域,，通常使用單個物鏡的多個光束進(jìn)行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_，這可以通過事后光源分離或時空復(fù)用來解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法,；時空復(fù)用法是指同時使用多個激發(fā)光束，每個光束的脈沖在時間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離,。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會導(dǎo)致熒光衰減時間重疊增加,，從而限制了分辨信號源的能力,；并且復(fù)用對電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比,，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。全自動多光子顯微鏡層析成像多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù)，利用多光子激發(fā)熒光的原理來觀察生物樣品的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,。

    多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,，而日本以尼康和奧林巴斯公司為,，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場64.44%的市場份額,，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向,。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快,，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

Sternand Jean Marx在評論中說：祖家能夠在更為精細(xì)的層次研究樹突的功能,，這在以前是完全不可能的。新的技術(shù)（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計(jì)算和神經(jīng)信號處理中的作用有了更好的理解,。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性,，及其獨(dú)特的電、及其獨(dú)特的電化學(xué)特征使神經(jīng)元完成了一系列的專門任務(wù),。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學(xué)中的應(yīng)用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次,，觀察24小時，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次,，觀察8小時后細(xì)胞分裂停止,，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細(xì)胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%。突破光學(xué)成像技術(shù)的限制,，多光子顯微鏡為科研工作提供新思路,。

   與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能,，極大地促進(jìn)了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識,。2019年，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù)。為了將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素,。雖然增加激光強(qiáng)度可以解決散射問題,，但會帶來其他問題，如燒焦樣品,、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外,，對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號。由于多光子激發(fā)的發(fā)生概率較低,，因此需要使用高功率的激光束來增加激發(fā)的幾率,。嚙齒類多光子顯微鏡三維分辨率

多光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布,、細(xì)胞活動等。bruker多光子顯微鏡原理

快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式,，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,，如圖2所示,。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來擴(kuò)大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描,，因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡,。bruker多光子顯微鏡原理