現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步,，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來(lái),，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型,，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律、分子間的相互作用,、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入、細(xì)致的研究,，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí),、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。在細(xì)胞的生理過(guò)程中,，基因,、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾和相萬(wàn)作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此,，發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí),、連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法非常必要。多光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等,。美國(guó)離體多光子顯微鏡單分子成像定位

國(guó)內(nèi)顯微鏡制造市場(chǎng)目前斷層嚴(yán)重,。目前我國(guó)顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營(yíng)積累的企業(yè)十分稀缺,，深度精密制造,、光學(xué)主要部件設(shè)計(jì)及工藝嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)升級(jí)。目前中國(guó)顯微鏡中如多光子顯微鏡,、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司、尼康,、奧林巴斯等國(guó)外企業(yè),。國(guó)內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國(guó)內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘,，切入顯微鏡市場(chǎng),，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)將騰躍至一個(gè)更高的格局,。未來(lái)國(guó)產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大。目前中國(guó)使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司,、尼康和奧林巴斯壟斷。國(guó)內(nèi)有能力開(kāi)始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少,，若國(guó)內(nèi)能夠制造出高性能,、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡，無(wú)異是會(huì)面臨極大的市場(chǎng)機(jī)遇,。清醒動(dòng)物多光子顯微鏡設(shè)備由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn),，多光子顯微鏡在神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究,、免疫學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用,。

2020年，TonmoyChakraborty等人提出了加速2PM軸向掃描速度的方法[2],。在光學(xué)顯微鏡中，物鏡或樣品緩慢的軸向掃描速度限制了體成像的速度,。近年來(lái),，通過(guò)使用遠(yuǎn)程聚焦技術(shù)或電調(diào)諧透鏡(ETL)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了快速軸向掃描。但遠(yuǎn)程對(duì)焦時(shí)對(duì)反射鏡的機(jī)械驅(qū)動(dòng)會(huì)限制軸向掃描速度,，ETL會(huì)引入球差和高階像差,，無(wú)法進(jìn)行高分辨率成像。為了克服這些限制,，該小組引入了一種新的光學(xué)設(shè)計(jì),，可以將橫向掃描轉(zhuǎn)換為無(wú)球面像差的軸向掃描，以實(shí)現(xiàn)高分辨率成像,。有兩種方法可以實(shí)現(xiàn)這種設(shè)計(jì),。***個(gè)可以執(zhí)行離散的軸向掃描，另一個(gè)可以執(zhí)行連續(xù)的軸向掃描,。如圖3a所示,，特定裝置由兩個(gè)垂直臂組成，每個(gè)臂具有4F望遠(yuǎn)鏡和物鏡,。遠(yuǎn)程聚焦臂由振鏡掃描鏡(GSM)和空氣物鏡(OBJ1)組成,，另一個(gè)臂(稱(chēng)為照明臂)由浸沒(méi)物鏡(OBJ2)組成。兩個(gè)臂對(duì)齊,，使得GSM與兩個(gè)物鏡的后焦平面共軛,。準(zhǔn)直后的激光束經(jīng)偏振分束器反射進(jìn)入遠(yuǎn)程聚焦臂，由GSM進(jìn)行掃描,，使OBJ1產(chǎn)生的激光焦點(diǎn)可以進(jìn)行水平掃描,。

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),，隨著刺激時(shí)間的增長(zhǎng)，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平,。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過(guò)程中,，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過(guò)程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過(guò)程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很強(qiáng)的變化,。多光子顯微鏡是一種高分辨率的顯微鏡技術(shù),，利用多光子激發(fā)熒光的原理來(lái)觀察生物樣品的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

2020年,，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置,，稱(chēng)為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦,，會(huì)聚角為Δθ,。光束進(jìn)入到一對(duì)幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S,，偏角為α,。經(jīng)過(guò)反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個(gè)傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α）,，脈沖間以2S/c的時(shí)間延遲（c,，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿(mǎn)物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm。光子顯微鏡利用光學(xué)透鏡和光學(xué)元件將樣品中的光反射或透射到目鏡中,，從而形成圖像,。激光掃描多光子顯微鏡數(shù)據(jù)處理

多光子顯微鏡，實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng),、無(wú)標(biāo)記的生物組織觀測(cè)方案,。美國(guó)離體多光子顯微鏡單分子成像定位

多光子顯微鏡成像深度深、對(duì)比度高,，在生物成像中具有重要意義,，但通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間傳播的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度,，但近紅外波段的光本身會(huì)導(dǎo)致分辨率較低,。基于多光子上轉(zhuǎn)換材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學(xué)教授和北京大學(xué)彭研究員合作開(kāi)發(fā)的,?？蓪?shí)現(xiàn)50MHz的超高掃描速度，突破衍射極限,，實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。與普通熒光顯微鏡相比,，該顯微鏡經(jīng)過(guò)改進(jìn),，只需要較低的激發(fā)功率。這種超快,、低功耗,、多光子超分辨率技術(shù)在高分辨率生物深層組織成像中具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。美國(guó)離體多光子顯微鏡單分子成像定位