要想實(shí)現(xiàn)離散的軸向重新聚焦,，需要在OBJ1的焦平面中放置一個(gè)階梯鏡（圖3b）,。當(dāng)入射激光束被OBJ1聚焦到的焦平面恰好與階梯重合時(shí)，被反射的激光將在無窮大的空間中成為準(zhǔn)直光束,，并在OBJ2的焦平面上形成激光光斑,。并且返回的激光束會(huì)被GSM消除橫向掃描，即OBJ2形成的焦點(diǎn)不會(huì)進(jìn)行橫向掃描,，實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。如果激光點(diǎn)被掃描到與焦平面不一致的階梯，則會(huì)形成遠(yuǎn)離鏡面的激光焦點(diǎn),，返回的激光束會(huì)在無窮大的空間中會(huì)聚或發(fā)散,，進(jìn)而導(dǎo)致由OBJ2形成的激光焦點(diǎn)也在軸向重新聚焦，通過這種方式即能實(shí)現(xiàn)離散的軸向掃描,。對(duì)于已精確匹配兩個(gè)物鏡光瞳的光學(xué)裝置,，不會(huì)引入像差。為了進(jìn)行連續(xù)的軸向重新聚焦,，將階梯鏡替換為稍微傾斜的平面鏡,，同時(shí)入射的激光焦點(diǎn)也需要被傾斜，使得其以垂直于鏡面的方向入射,，通過相對(duì)入射激光束稍微平移OBJ1即可實(shí)現(xiàn)這種傾斜,。多光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。美國布魯克多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出,，基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢,。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像,，空間分辨率∶1-2mm,，時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí)。與PET比較,，光學(xué)成像的應(yīng)用場合更廣（可測量更多的參數(shù),，請參見表1-1），且具有更高的時(shí)間分辨率（秒級(jí)）,，空間分辨率可達(dá)到微米,。因此，二者相比,，雖然光學(xué)成像在測量深度方面不及PET,，但在測量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對(duì)于小動(dòng)物（如小白鼠）研究來說,，光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像,。例如,，初步研究表明，熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像,。美國多光子顯微鏡單分子成像定位多光子顯微鏡-適用于各行各業(yè)的觀察需求,。

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長波長的光子,，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率。

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進(jìn)步,，特別是隨著后基因組時(shí)代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細(xì)胞模型，為在體研究基因表達(dá)規(guī)律,、分子間的相互作用,、細(xì)胞的增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化,、細(xì)胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法,，已經(jīng)對(duì)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用進(jìn)行了深入,、細(xì)致的研究,，但仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測,。在細(xì)胞的生理過程中,，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達(dá),、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的,、動(dòng)態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化，但獲取這些信息對(duì)與研究基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要,。因此,，發(fā)展能用于、動(dòng)態(tài),、實(shí)時(shí),、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動(dòng)的方法是非常必要的。雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。

細(xì)胞在受到外界刺激時(shí),，隨著刺激時(shí)間的增長，即使刺激繼續(xù)存在,，Ca2+熒光信號(hào)不但不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng),，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到未加刺激物時(shí)的水平,。對(duì)于細(xì)胞受精過程中Ca2+熒光信號(hào)的變化情況,，研究發(fā)現(xiàn)，配了在粘著過程中,，Ca2+熒光信號(hào)未發(fā)生任何變化,，而配子之間發(fā)生融合作用時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度卻會(huì)出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值,，并可持續(xù)幾分鐘,。這些現(xiàn)象，對(duì)研究受精發(fā)育的早期信號(hào)及Ca2+在卵細(xì)胞和受精卵的發(fā)育過程中的作用具有重要的意義,。在其它一些生理過程如細(xì)胞分裂,、胞吐作用等，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很的變化,。由于雙光子激發(fā)的特性,，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率。美國熒光多光子顯微鏡Ultima Investigator

高精度,，低光損,，多光子顯微鏡為科研提供準(zhǔn)確依據(jù)。美國布魯克多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析

雙光子熒光顯微成像主要有以下優(yōu)點(diǎn):a.光損傷小:雙光子熒光顯微以可見光或近紅外光為激發(fā)光,，對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小,，適合長期研究；b.穿透力強(qiáng):與紫外光,、可見光或近紅外光相比,，穿透力強(qiáng)，可用于生物樣品的深入研究；c.高分辨率:由于雙光子吸收截面很小P,，熒光只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā),，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)λ左右的體積內(nèi)；d.漂白區(qū)域很小,，焦點(diǎn)外不發(fā)生漂白,。E.高熒光收集率與共焦成像相比，雙光子成像不需要濾光片,，提高了熒光收集率,。采集效率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。F.對(duì)探測光路要求低,。由于激發(fā)光和發(fā)射熒光的波長差越來越大,，加上自發(fā)三維濾波效應(yīng)，多光子顯微鏡對(duì)光路采集系統(tǒng)的要求遠(yuǎn)低于單光子共焦顯微鏡,，光學(xué)系統(tǒng)也相對(duì)簡單,。G.適用于多標(biāo)簽復(fù)合測量許多染料熒光探針的多光子激發(fā)光譜比單光子激發(fā)光譜更寬，從而可以用單一波長的激發(fā)光同時(shí)激發(fā)多種染料,，獲得同一生命現(xiàn)象的不同信息,，便于相互比較和補(bǔ)充。美國布魯克多光子顯微鏡數(shù)據(jù)分析