與傳統(tǒng)的單光子寬場熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡(MPM)具有光學(xué)切片和深度成像的功能，極大地促進(jìn)了研究人員對整個大腦深部神經(jīng)的認(rèn)識,。2019年,，JeromeLecoq等從腦深部神經(jīng)元成像,、大數(shù)量神經(jīng)元成像,、高速神經(jīng)元成像三個方面討論了相關(guān)的MPM技術(shù)。為了將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮層深處的神經(jīng)元進(jìn)行成像,，這就要求MPM具備深度成像的能力,。激發(fā)光和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收，這是限制MPM成像深度的主要因素,。雖然增加激光強度可以解決散射問題,，但會帶來其他問題，如燒焦樣品,、散焦和近表面熒光激發(fā),。增加MPM成像深度的比較好方法是使用更長的波長作為激發(fā)光。另外,，對于雙光子（2P）成像而言,，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。多光子顯微鏡,，提高醫(yī)學(xué)病理診斷的準(zhǔn)確性和效率,。飛秒激光多光子顯微鏡供應(yīng)商

Ca2+是重要的第二信使，對于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理反應(yīng)具有極其重要的作用,，開發(fā)和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)對Ca2+熒光信號進(jìn)行觀測,，可以從某些方面對有機體或細(xì)胞的變化機制進(jìn)行分析，具有重要的意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)可以觀察細(xì)胞內(nèi)用熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時間和空間的熒光圖像的變化,，還可以觀察細(xì)胞某一層面或局部的（Ca2+）熒光圖像和變化。通過對單細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+不僅在細(xì)胞局部區(qū)域間的分布是不均勻的,，而且細(xì)胞內(nèi)各局部區(qū)域的不同深度或?qū)哟伍g也存在不同程度的Ca2+梯差即所謂的空間Ca2梯差。美國在體多光子顯微鏡價格多少多光子顯微鏡,，實現(xiàn)無創(chuàng),、實時、動態(tài)的生物組織觀測,。

根據(jù)阿貝成像原理,，許多光學(xué)成像系統(tǒng)是一個低通濾波器，物平面包含從低頻到高頻的信息,，透鏡口徑會限制高頻信息通過,，只允許一定的低頻通過，因此丟失了高頻信息會使成像所得圖像的細(xì)節(jié)變模糊,，降低分辨率,。對于三維成像來說，寬場照明時得到的信息不僅包含物鏡焦平面上樣品的部分信息，同時還包含焦平面外的樣品信息,。由于受到焦平面外的信息干擾,，常規(guī)熒光顯微鏡無法獲得層析圖像。三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡能夠提高分辨率,、獲得層析圖像,，是因為利用特定結(jié)構(gòu)的照明光能引入樣品的高頻信息，當(dāng)結(jié)構(gòu)光的空間頻率足夠高時,，只有靠近焦面的部分才能被結(jié)構(gòu)光調(diào)制,，超出這一區(qū)域，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆蛘彰?，也就是只有焦面附近的有限區(qū)域具有相對完整的頻譜信息,，離焦后，高頻信息迅速衰減,，所以使用高頻結(jié)構(gòu)光照明可以區(qū)分焦面和離焦區(qū)域來獲得層析圖像,。然后再通過軸向掃描可以獲取樣品不同深度的焦面圖像，重建樣品的三維結(jié)構(gòu),。

多束掃描技術(shù)可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進(jìn)行成像,。該技術(shù):對于兩個遠(yuǎn)程成像位置(相距1-2mm以上)，通常采用兩個**的路徑進(jìn)行成像,；對于相鄰區(qū)域,，通常使用單個物鏡的多個光束進(jìn)行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過事后光源分離或時空復(fù)用來解決,。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法；時空復(fù)用法是指同時使用多個激發(fā)光束,，每個光束的脈沖在時間上被延遲,，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多,，但多束會導(dǎo)致熒光衰減時間重疊增加，從而限制了分辨信號源的能力,；并且復(fù)用對電子設(shè)備的工作速度要求很高,；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。多光子顯微鏡,，突破生物組織成像深度，洞察細(xì)胞間的奧秘,。

單光子激發(fā)熒光的過程,，就是熒光分子吸收一個光子,，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，躍遷以后,，能量較大的激發(fā)態(tài)分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換把部分能量轉(zhuǎn)移給周圍的分子,，自己回到比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級,。處于比較低電子激發(fā)態(tài)的比較低振動能級的分子的平均壽命大約在10s左右。這時它不是通過內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式來消耗能量,，回到基態(tài),，而是通過發(fā)射出相應(yīng)的光量子來釋放能量，回到基態(tài)的各個不同的振動能級時,，就發(fā)射熒光,。因為在發(fā)射熒光以前已經(jīng)有一部分能量被消耗，所以發(fā)射的熒光的能量要比吸收的能量小,，也就是熒光的特征波長要比吸收的特征波長來的長,。突破傳統(tǒng)光學(xué)成像極限，多光子顯微鏡適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境,。共聚焦多光子顯微鏡實驗操作

雙光子顯微鏡可以在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行成像,，這對于研究細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)過程非常有用。飛秒激光多光子顯微鏡供應(yīng)商

快速光柵掃描有多種實現(xiàn)方式,，使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,，將振鏡和可調(diào)電動透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描，但可調(diào)電動透鏡由于機械慣性的限制在軸向無法快速進(jìn)行焦點切換,，影響成像速度,，現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器（SLM）代替。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實現(xiàn)3D成像的手段,，如圖2所示,。在LSU模塊中，掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描,，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)控M的位置實現(xiàn)軸向掃描。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進(jìn)行快速的軸向掃描,。想要獲得更多神經(jīng)元成像，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來擴大FOV,，但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,，無法快速移動以進(jìn)行快速軸向掃描，因此大型FOV系統(tǒng)依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動透鏡,。飛秒激光多光子顯微鏡供應(yīng)商