雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等。ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

首先,，雙光子成像采用波長(zhǎng)范圍約在700~1000 nm的近紅外光激發(fā),，在組織中的散射系數(shù)較小，穿透性很好,，因此非常適合厚樣本的觀察,。同時(shí)，由于是近紅外光激發(fā),，也能避免樣品中激發(fā)波長(zhǎng)較短的自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾,，可獲得較強(qiáng)的熒光信號(hào)（如下圖）。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性,。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達(dá)200~500 μm,，能夠較好地進(jìn)行三維成像。雙光子成像的另一大優(yōu)勢(shì)在于精確的空間點(diǎn)聚焦性,。一般條件下,，物質(zhì)只會(huì)被單光子激發(fā)，只有在光子密度足夠高的情況下,，物質(zhì)才會(huì)吸收兩個(gè)光子從而被激發(fā),，所以，雙光子只會(huì)在光子密度蕞高的物鏡焦點(diǎn)附近發(fā)生,，很少產(chǎn)生焦平面外的雜散光（如下圖）,。這種性質(zhì)既提高了成像質(zhì)量，也降低了樣本的光漂白,、光損傷區(qū)域,。基于這些優(yōu)勢(shì),，使得雙光子顯微鏡非常適合對(duì)活細(xì)胞,、活組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間在體成像。雙光子顯微鏡商家電話雙光子顯微鏡型號(hào)有哪些,？

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí),，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響,。

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，從而被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?

使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng),；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說太快,。目前電壓成像主要通過寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。國(guó)內(nèi)investigator雙光子顯微鏡分辨率

雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中,；ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷