目前,，世界各國(guó)的腦科學(xué)研究如火如荼,，中國(guó)的腦計(jì)劃也即將啟動(dòng),。其中,，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究成為重點(diǎn)研究方向，而如何打破尺度壁壘,，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的信息處理和個(gè)體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。2021年1月6日，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭,，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系,、工學(xué)院以及中國(guó)人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊(duì)，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章,。文中報(bào)道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時(shí)具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像，并且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)同一批神經(jīng)元長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄,。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點(diǎn),，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)

2020年,，臨研所,、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛(ài)民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來(lái)即時(shí)病理,、離體組織檢測(cè)、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。進(jìn)口布魯克雙光子顯微鏡磷光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測(cè),。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí),，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。雙光子顯微鏡在多個(gè)領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例,。

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子過(guò)期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢(qián)了,。其次是靈活，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配,，改動(dòng)也靈活,。好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái),，后期維護(hù)也更加自由。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心,，特別是第1次搭的時(shí)候，開(kāi)始要想方案,，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題,。其次是花時(shí)間，加上買(mǎi)配件的時(shí)間,，比買(mǎi)一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol,，大多是老外寫(xiě)的,，中文的較少。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,，容易走彎路，多花錢(qián),，也多花時(shí)間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買(mǎi)，在國(guó)內(nèi)買(mǎi)這些東西耗時(shí)較長(zhǎng),。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn)，貼出來(lái)分享,，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室,，雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。進(jìn)口熒光激光雙光子顯微鏡的原理

雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的,；進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)

首先我們來(lái)簡(jiǎn)單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對(duì)其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過(guò)探測(cè)器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測(cè)器接收,。也就是說(shuō),，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè),。通過(guò)點(diǎn)掃描的方式,，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像,。不同的是,，其采用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號(hào),。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn),，出才會(huì)激發(fā)出熒光。也就是說(shuō),，雙光子顯微鏡中,，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有,。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)