WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊。從雙光子到三光子科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少,？美國2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級成像,，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r、在體,、原位,、無創(chuàng)地，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,，區(qū)分成像,；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光,、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。雙光子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力,，該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術(shù),，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu),、生化成分、微環(huán)境,、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細(xì)胞學(xué),、分子生物學(xué),、組織病理學(xué)、診斷和***特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制,，篩選鑒定**、皮膚病,、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),，建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn),。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野雙光子顯微鏡的探測器,該怎么選用?

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米,，甚至超過1毫米。另外,，同時吸收兩個光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點,、有生命體的觀察！

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng),？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間,。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了,。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強(qiáng),。類似的，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因為瑞利散射的強(qiáng)度反比于波長λ的四次方,。類似的，早晨的太陽非常紅,，也就是因為長波長的紅光穿透力更強(qiáng),。這兩點共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強(qiáng)。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；美國熒光雙光子顯微鏡授權(quán)商

對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡,。美國2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少

目前，世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼,，中國的腦計劃也即將啟動,。其中，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點研究方向,，而如何打破尺度壁壘,，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn),。2021年1月6日,，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系,、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團(tuán)隊,，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,，其成像視野是該團(tuán)隊于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時具備三維成像能力，獲取了小鼠在自由運(yùn)動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像,，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄,。美國2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少